دراسة المجتمعات الميكروبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو بناء نموذج لدراسة التفاعلات بين بكتيريا واحدة وفطر واحد. يمكن أن تساعد هذه المنهجية في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تفاعلات الممرضات، مثل العوامل المشاركة في التواصل المتبادل والتبادل النوعي بين الأنواع. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن البيانات الناتجة عن هذا النموذج الحي (in vivo) لها صلة سريرية.

لتثبيت الفطر عن طريق الأنف، قم أولاً بتخفيف 2×10⁶ CFU من *C.albicans* لكل ملليلتر في PBS معقم. بعد ذلك، وبعد التأكد من فقدان منعكس التصحيح في فأر بالغ يعاني من نقص التوتر، اسحب 50 µL على الأقل من المعلق الفطري باستخدام ماصة سعة 200 µL. الآن، أمسك الفأر بيد واحدة وأدر الحيوان بحيث يكون مستلقياً على ظهره وبطنه متجهاً للأعلى.

عندما يكون الفأر في الوضعية الصحيحة، استخدم سبابة اليد التي تمسك الفأر لدعم الرأس، والإبهام لإبقاء الفك مغلقاً، ثم حرك طرف الماصة بالقرب من أنف الحيوان. بعد ذلك، قم بتوزيع قطرة بحجم 50 µL من الفطر بعناية على فتحات الأنف، مع السماح باستنشاق القطرة عن طريق التنفس التلقائي للفأر. ثم ضع الفأر بمفرده في قفص حتى يتعافى تماماً.

بعد أربعة أيام من استزراع *C.albicans*، قم بحلاقة بطن الحيوان الذي تم القتل الرحيم له، يتبع ذلك تعقيم الجلد المكشوف باستخدام الإيثانول. بعد ذلك، استخدم مقصاً لفتح الجلد من القص وصولاً إلى منتصف البطن. ثم قم بتوسيع الشق على طول القفص الصدري على جانبي الخط الناصف واطوِ الجلد للخلف على جانبي الصدر.

عندما يصبح القفص الصدري مرئياً، قم بإجراء شق عمودي على كلا جانبي الصدر باتجاه الترقوتان، واستخدم عظمة القص لإرجاع جدار الصدر الأمامي بالكامل لرؤية القلب والرئتين. بعد ذلك، وباستخدام سرنجة معالجة مسبقاً بالهيبارين، قم بثقب القلب بجوار الشريان البطيني، واسحب 500 µL كحد أدنى من الدم. ضع عينة الدم على الثلج.

بعد ذلك، يتم إجراء شق عنقي في الخط الناصف لكشف القصبة الهوائية. يتم تشريح اللفافة المحيطة بالقصبة الهوائية بعناية، يليه وضع غرزة جراحية أسفل القصبة الهوائية. ثم تُستخدم إبرة تغذية أنبوبية معدلة مقاس 20-gauge لقثطرة القصبة الهوائية، مع تثبيت القنية بواسطة الغرزة التي تم وضعها مسبقاً.

لإجراء غسيل قصبي سنخي، قم بتوزيع 500 µL من محلول PBS المبرد بالثلج برفق داخل الرئة. بعد ذلك، قم بشفط سائل الغسيل ونقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 mL على الثلج. وبعد جمع عينتين إضافيتين بحجم 500 µL، قم بإزالة الرئتين من الصدر، وضع قطعة من الرئة في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 mL للتخزين الفوري عند درجة حرارة -80 °C.

بعد ذلك، ضع قطعة أخرى من نسيج الرئة في أنبوب تحلل دم موزون مسبقاً ويحتوي على PBS على الثلج. وأخيراً، قم بإجراء شق في الجانب الأيسر من البطن. استخلص الطحال في أنبوب تحلل دم ثانٍ يحتوي على 1 mL من PBS وضع الأنبوب على الثلج.

يتم الحصول على نموذج استمرارية لمدة أربعة أيام عن طريق التثبيت عبر الأنف لـ 5 × 10⁵ CFU من فطريات C.albicans لكل فأر. خلال هذه الأيام الأربعة، تزداد أوزان الفئران، ولكنها لا تظهر إصابة رئوية. ومع ذلك، كلما زاد عدد CFU في اللقاح، زادت الإصابة الرئوية.

حيث لُوحظت أقصى إصابة رئوية في الفترة ما بين 24 إلى 36 ساعة بعد العدوى. وفي المقابل، يُظهر العبء البكتيري انخفاضاً بمقدار لوغاريتم واحد من CFU لكل مليلتر كل 24 ساعة، مع ملاحظة زيادة تراكمية في الانتشار البكتيري على مدار كل يوم. وفي غسيل القصبات والأسناخ الذي تم جمعه من الفئران المصابة، يتم استقطاب الخلايا المتعادلة على نطاق واسع، حيث أظهر تعداد الخلايا التفريقي أن مجموعة الخلايا المناعية المرتشحة تتكون من 90% من الخلايا المتعادلة و10% من الخلايا البلعمية واللمفاوية.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل غسيل القصبات والأسناخ للإجابة على أسئلة إضافية حول توصيف الاستجابة الالتهابية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية بناء استعمار Pseudomonas. لا تنسَ أن العمل مع Candida المضيئة يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات، مثل ارتداء معدات الوقاية لتجنب التلوث بالرذاذ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.