في المختبر نموذج الفسيولوجية والمرضية تدفق الدم مع التطبيق على التحقيقات الأوعية الدموية إعادة عرض خلية

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة آثار اعتلالات التدفق النبضي المختلفة على الخلايا البطانية مخبرياً (In vitro). ويتحقق ذلك من خلال المعالجة الكيميائية للشرائح الزجاجية أولاً، ثم طلائها بالبروتين لضمان التصاق الخلايا أثناء التعرض للتدفق.

كخطوة ثانية، يتم تحديد مؤشر النبض للتدفق، مما يسمح بمقارنة التدفق في المختبر بالقيم الموصوفة في الدراسات السابقة. بعد ذلك، يتم توصيل الشرائح التي استقرت عليها الخلايا بنظام التدفق لقياس استجابة الخلايا لاعتلالات التدفق. وتظهر النتائج تغيرات في المورفولوجيا والتعبير البروتيني بناءً على ملفات التدفق باستخدام المجهر الضوئي والتلوين المناعي الفلوري.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالمضخة التمعجية أو النابضة في القدرة على ضبط نبض التدفق لمحاكاة الاستجابة المرضية أو الصحية. ويمكن أن يساعد ذلك في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أمراض الشرايين. للبدء، ضع شرائح زجاجية جديدة بقياس 75 millimeters by 50 millimeters by 1 millimeter في وعاء صبغ زجاجي نظيف.

ثم أضف كمية كافية من محلول حمض الكبريتيك بتركيز 20% لغمر الشرائح الزجاجية بالكامل، واتركها في محلول الحمض طوال الليل حتى اليوم التالي. اغسل الشرائح ثلاث مرات عن طريق غمرها في ماء منزوع الأيونات متجدد لمدة خمس دقائق في كل مرة. وبمجرد شطفها، اغمر الشرائح في الأسيتون لمدة 30 دقيقة، ثم اتركها طوال الليل في محلول من 6% three amino propyl trixi seline في الأسيتون.

بعد ذلك، اشطف الشرائح ثلاث مرات في أسيتون نقي لمدة خمس دقائق، مع تغيير الأسيتون بعد كل غسلة. ثم اغسل الشرائح ثلاث مرات في ماء منزوع الأيونات لمدة خمس دقائق، مع تغيير الماء منزوع الأيونات بعد كل غسلة. ثم اغمر الشرائح في glutaraldehyde بتركيز 1.5% واتركها مغمورة لمدة 60 دقيقة.

بمجرد إتمام عملية الربط التشابكي، اغسل الشرائح مرتين بماء منزوع الأيونات، مع تغيير الماء منزوع الأيونات بعد كل غسلة، ثم ضع الشرائح في إيثانول بتركيز 70% لمدة 30 دقيقة لتعقيمها. أزل الإيثانول واترك أي بقايا متبقية تتبخر من الشرائح. وبمجرد أن تجف، قم بإعادة ترطيب الشرائح بوضعها لفترة وجيزة في ماء منزوع الأيونات معقم.

بعد ذلك، قم بإزالة حامل الشريحة ووضعه في طبق بتري مربع مقاس 100 millimeter في 100 millimeter. في غطاء التدفق الصفائحي، قم بتغطية الشريحة الوظيفية بـ 1 milliliter من محلول fibronectin بتركيز 25 microgram per milliliter، بحيث تغطي المنطقة التقريبية التي ستكون معرضة لغرفة زراعة الخلايا. ثم غطِّ الطبق واحضن الشرائح عند 37 degrees Celsius لمدة ساعة إلى ساعتين. بعد الحضن، قم بشفط المحلول المتبقي وزرع 600,000 من الخلايا البطانية في 1 milliliter من DMEM مع 10% FBS على الجانب المغطى من الشريحة.

قم بتغطية الغرفة ثم حضن الخلايا عند 37 °C و5% carbon dioxide لمدة 120 دقيقة. بعد ذلك، غطِّ الخلايا بوسط غذائي إضافي واستمر في تحضينها حتى تصل درجة الالتحام إلى 70 إلى 80%. قم بتوصيل دائرة التدفق كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق وكما هو مبين هنا، مع التأكد من ترتيب غرفة التخميد ومقياس التدفق بالموجات فوق الصوتية في اتجاه التدفق الصحيح.

بعد ذلك، قم بملء مسار الدائرة والخزان بالماء منزوع الأيونات. تأكد من أن أنبوب مخرج الخزان مغمور داخل حجم السائل في الخزان. ثم قم بمعاينة شكل موجة التدفق باستخدام مقياس التدفق.

افتح صمام تنفيس الهواء في غرفة التخميد لتغيير نسبة حجم السائل إلى الهواء. أغلق صمام تنفيس الهواء عند فترات مختلفة من مستويات السائل واحسب مؤشر النبضية. ولحساب هذا المؤشر، قم بتقييم شكل موجة التدفق حيث تمثل القمة قيمة VM max.

يمثل القاع قيمة v min، بينما يمثل V mean متوسط سجل الإشارة. سجل قيم مؤشر النبض (puls index) في دفتر ملاحظات. حدد مستوى السائل الناتج ومؤشر التذبذب (pulsatility index) على غرفة التخميد باستخدام قلم تخطيط دائم ذو سن لبادي للاستخدام المستقبلي.

حدد مستويات مؤشر النبض المطلوبة من مراجع أدبيات علم الأمراض الواردة في البروتوكول النصي المرفق أثناء تحضير عملية إحماء غرفة التدفق. DMEM مضاف إليه 1%FBS في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. أخرج إحدى الشرائح المطلية بالخلايا من الوسط بمجرد أن تصل درجة تلاقي الخلايا إلى 70 إلى 80%، ثم ضع حاشية على الجانب الذي تستقر عليه الخلايا.

بعد ذلك، قم بمحاذاة قناة الفراغ في غرفة التدفق مع الثقوب الموجودة في الحشية. ثم قم بتوصيل أنابيب الفراغ بمنافذ الفراغ، مع التأكد من عدم تسرب أي من الوسط إلى الفراغ. ضع شريحة من البولي كربونات أسفل الشريحة الزجاجية، ثم قم بتثبيت مجموعة غرفة التدفق باستخدام مشبك زنبركي واحد على كل من الجانبين القصيرين، ومشبكين زنبركيين على طول الجوانب الطويلة لغرفة التدفق.

بعد ذلك، قم بتوصيل غرفة التدفق والمدخل والمخرج بدائرة التدفق. ضع نظام التدفق في حاضنة مضبوطة على 37 درجة Celsius و5% carbon dioxide، ثم املأ الدائرة بالوسط الغذائي المسخن مسبقاً عن طريق ملء الخزان بالوسط وضخه بنبضية منخفضة. حافظ على هذا التدفق لمدة أربع ساعات لتهيئة الخلايا.

بعد ذلك، اضبط حجم السائل في غرفة التخميد وفقاً لمستوى مؤشر النبض المحدد مسبقاً، ثم قم بزراعة الخلايا للمدة المطلوبة. وقد تمت زراعة الخلايا البطانية الموضحة هنا في ظروف عدم التدفق، والتدفق الثابت، والتدفق النبضي.

يمكن ملاحظة تغيرات في المورفولوجيا، حيث تتحول مورفولوجيا الخلايا البطانية النموذجية إلى مورفولوجيا أكثر شبهاً بالمغزل بعد 24 ساعة من التعرض لتدفق نبضي عالٍ. بينما يظهر كل من التدفق الساكن والتدفق المستقر اختلافاً ضئيلاً أو معدوماً في المورفولوجيا. كما تتأثر خلايا العضلات الملساء بالزراعة المشتركة مع الخلايا البطانية المعرضة لتدفق نبضي عالٍ، كما هو موضح هنا من خلال مستويات مختلفة من alpha smooth muscle actin و myosin heavy chain.

خلال ظروف التدفق المتغيرة، أظهرت الخلايا التي تعرضت للتدفق النبضي أكبر كميات من كلا البروتينين، وهو ما يشير إلى تضخم العضلات والقدرة على الانقباض. وعند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على جميع السدادات وضمان بقاء مستويات السوائل ثابتة بعد هذا الإجراء. ويمكن إجراء طرق أخرى مثل الزراعة المشتركة للخلايا البطانية والخلايا الوعائية للإجابة على أسئلة إضافية مثل التفاعلات بين الخلايا.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع دائرة التدفق، والتحكم في المؤشر، وتعريض الخلايا البطانية لتدفق نبضي.