في المختبر نموذج الفسيولوجية والمرضية تدفق الدم مع التطبيق على التحقيقات الأوعية الدموية إعادة عرض خلية
نوفمبر 3, 2015
هذا البروتوكول يعيد الفسيولوجية أو المرضية تدفق الدم في المختبر للمساعدة في تحديد استجابة الخلايا في أمراض المرض. عن طريق إدخال ضغط التخميد غرفة المصب مضخة الدم، وتدفق الدم عبر الأوعية الدموية ويمكن تلخيصها وفرضت على أحادي الطبقة من بطانة الأوعية الدموية أو المحاكاة ثقافة مشتركة.
الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة تأثيرات أمراض التدفق النابض المختلفة على الخلايا البطانية. في المختبر. يتم تحقيق ذلك عن طريق المعالجة الكيميائية أولا للشرائح الزجاجية وتغطيتها بالبروتين لضمان ارتباط الخلية أثناء التعرض للتدفق.
كخطوة ثانية ، يتم تحديد مؤشر النبض للتدفق ، مما يسمح بمقارنة التدفق في المختبر بالقيم الموضحة في الأدبيات. يتم توصيل الشرائح التي تجلس الخلية التالية بنظام التدفق من أجل قياس استجابة الخلية لأمراض التدفق. تظهر النتائج تغيرات في التشكل والتعبير عن البروتين بناء على ملامح التدفق باستخدام الفحص المجهري البصري والتلوين المناعي الفلوري.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية على المضخة التمعجية أو النابضة هي القدرة على ضبط نبض التدفق لتقليد الاستجابة المريضة أو الصحية. يمكن أن يساعد هذا في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الشرايين. للبدء ، ضع شرائح زجاجية جديدة بقياس 75 ملم × 50 ملم × ملليمتر واحد في طبق تلطيخ زجاجي نظيف.
ثم أضف ما يكفي من محلول حامض الكبريتيك بنسبة 20٪ لغمر الشرائح الزجاجية بالكامل واحتضانها في المحلول الحمضي طوال الليل في اليوم التالي. اغسل الشرائح ثلاث مرات عن طريق غمرها في ماء منزوعة الأيونات لمدة خمس دقائق في كل مرة. بمجرد شطفها ، اغمر الشرائح في الأسيتون لمدة 30 دقيقة ، ثم طوال الليل في محلول 6٪ من أمينو بروبيل تريكسي سيلين في الأسيتون.
بعد ذلك ، اشطف الشرائح ثلاث مرات في الأسيتون النقي لمدة خمس دقائق مع تغيير الأسيتون بعد كل غسلة. ثم اغسل الشرائح ثلاث مرات في ماء منزوع الأيونات لمدة خمس دقائق ، مع تغيير الماء منزوع الأيونات بعد كل غسلة. بعد ذلك ، اغمر الشرائح في 1.5٪ جلوتارالديهايد واتركها مغمورة لمدة 60 دقيقة.
بمجرد الربط المتقاطع ، اغسل الشرائح مرتين في ماء منزوع الأيونات ، وقم بتغيير الماء منزوع الأيونات بعد كل غسلة ، ثم ضع الشرائح في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة لتعقيمها. قم بإزالة الإيثانول واترك أي بقايا متبقية تتبخر من الشرائح. بمجرد أن تجف ، أعد ترطيب الشرائح عن طريق وضعها لفترة وجيزة في ماء معقم منزوع الأيونات.
بعد ذلك ، قم بإزالة حامل الشريحة وضعه في طبق بتري 100 ملم × 100 ملم مربع. في غطاء التدفق الصفحي ، قم بتغطية الشريحة الوظيفية بمليلتر واحد من محلول فيبرونيكتين 25 ميكروغرام لكل مليلتر ، يغطي المنطقة التقريبية التي ستتعرض لغرفة زراعة الخلايا. ثم قم بتغطية الطبق واحتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين بعد الحضانة ، قم بشفط المحلول المتبقي وزرع 600،000 خلية بطانية في مليلتر واحد من DMEM مع 10٪ FBS على الجانب المطلي من الشريحة.
قم بتغطية الغرفة ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 120 دقيقة. ثم قم بتغطية الخلايا بوسيط إضافي واستمر في احتضانها حتى تصبح 70 إلى 80٪ ملتقية. قم بتوصيل دائرة التدفق كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب وكما هو موضح هنا ، تأكد من ترتيب غرفة التخميد ومقياس التدفق بالموجات فوق الصوتية في اتجاه التدفق الصحيح.
بعد ذلك ، املأ التدفق والدائرة والخزان بالماء منزوع الأيونات. تأكد من أن أنبوب مخرج الخزان مغمور داخل حجم الخزان. ثم تصور شكل موجة التدفق باستخدام مقياس التدفق.
افتح صمام تحرير الهواء في غرفة التخميد لتغيير نسبة السائل إلى حجم الهواء. أغلق صمام تحرير الهواء على فترات مختلفة من مستوى السوائل واحسب مؤشر النبض. لحساب الفهرس، قم بتقييم شكل موجة التدفق حيث تمثل الذروة الحد الأقصى للجهاز الظاهري.
يمثل الحوض الصغير v min ومتوسط V هو متوسط سجل الإشارة. قيم فهرس النبض في دفتر ملاحظات. ضع علامة على مستوى السائل الناتج ومؤشر النبض على حجرة التخميد باستخدام قلم حبر دائم مائل لباد للاستخدام في المستقبل.
حدد مستويات مؤشر النبض المطلوبة من أدبيات علم الأمراض المشار إليها في بروتوكول النص المصاحب أثناء تحضير إحماء غرفة التدفق. DMEM مكمل ب 1٪ FBS في حمام مائي 37 درجة مئوية. خذ إحدى الشرائح المطلية بالخلية من الوسائط بمجرد أن تتصادم بنسبة 70 إلى 80٪ وضع حشية أعلى جانب الخلية الجالس.
بعد ذلك ، قم بمحاذاة قناة التفريغ لغرفة التدفق مع الفتحات الموجودة في الحشية. ثم قم بتوصيل أنابيب التفريغ بمنافذ التفريغ ، مما يضمن عدم تسرب الوسائط إلى الفراغ. ضع لوحا من البولي كربونات أسفل الشريحة الزجاجية وقم بتثبيت مجموعة غرفة التدفق بمشبك زنبركي واحد على كل جانب من الجانبين القصيرين ومشابك زنبركية على طول الجوانب الطويلة لغرفة التدفق.
بعد ذلك ، قم بتوصيل غرفة التدفق والمدخل والمخرج بدائرة التدفق. ضع نظام التدفق في حاضنة مثبتة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون واملأ الدائرة بوسائط التسخين المسبق عن طريق ملء الخزان بالوسائط وضخها عند نبض منخفض. حافظ على هذا التدفق لمدة أربع ساعات لتكييف الخلايا مسبقا.
ثم اضبط حجم السائل في غرفة التخميد على مستوى مؤشر النبض المشار إليه مسبقا والثقافة. الخلايا للمدة المطلوبة. تم زراعة الخلايا البطانية الموضحة هنا بدون تدفق وتدفق ثابت وتدفق نابض.
يمكن رؤية التغييرات في التشكل من مورفولوجيا الخلية البطانية النموذجية إلى مورفولوجيا أكثر شبها بالمغزل بعد 24 ساعة من التعرض لتدفق نابض عالي. في حين أن كلا من التدفق الثابت والثابت يظهران اختلافا طفيفا أو معدوما في التشكل. تتأثر خلايا العضلات الملساء أيضا بالزراعة المشتركة مع الخلايا البطانية المعرضة لتدفق نابض عال كما هو موضح هنا من خلال مستويات مختلفة من أكتين العضلات الملساء ألفا وسلسلة الميوسين الثقيلة.
خلال ظروف التدفق المتغيرة ، أظهرت الخلايا التي تعرضت للتدفق النابض أكبر كميات من كلا البروتينين ، مما يدل على التضخم والانقباض. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على جميع موانع التسرب والتأكد من بقاء مستويات السوائل ثابتة بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل الخلايا البطانية والزراعة المشتركة لخلايا الأوعية الدموية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تفاعلات الخلية إلى الخلية.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تجميع دائرة التدفق ، والتحكم في الفهرس ، وتعريض الخلايا البطانية للتدفق النابض.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
النظرة العامة
يُكرر هذا البروتوكول تدفق الدم الفسيولوجي أو المرضي في المختبر للمساعدة في تحديد استجابة الخلايا في أمراض الأمراض. يركز التجربة على ملاحظة تأثيرات أمراض التدفق النبضي المختلفة على الخلايا البطانية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- بيولوجيا الأوعية الدموية
الخلفية
- فهم استجابة الخلايا البطانية أمر بالغ الأهمية لدراسة أمراض الأوعية الدموية.
- التدفق النبضي يمكن أن يقلد الظروف الفسيولوجية في المختبر.
- أظهرت الدراسات السابقة أن ظروف التدفق تؤثر على شكل الخلية ووظيفتها.
- تهدف هذه الدراسة إلى تكرار هذه الظروف لدقة تجريبية أفضل.
غرض الدراسة
- لملاحظة تأثيرات أمراض التدفق النبضي على الخلايا البطانية.
- لتأسيس نموذج موثوق في المختبر لأبحاث الأوعية الدموية.
- لقياس التغييرات في شكل الخلية وتعبير البروتين بسبب ملفات التدفق.
الطرق المستخدمة
- العلاج الكيميائي لألواح الزجاج لإرفاق الخلايا.
- تغليف الشرائح بالبروتين لتسهيل نمو الخلايا البطانية.
- تحديد مؤشر النبضية للتدفق للمقارنة مع الأدبيات.
- توصيل الشرائح التي تجلس الخلايا إلى نظام تدفق لقياس الاستجابات.
النتائج الرئيسية
- لوحظت تغييرات في شكل الخلايا البطانية تحت ظروف تدفق مختلفة.
- تختلف مستويات تعبير البروتين بناءً على ملفات التدفق المطبقة.
- استخدمت المجهر البصري والتلوين المناعي الفلوريسنسي لتحليل النتائج.
- توفر الدراسة رؤى حول كيفية تأثير أمراض التدفق على سلوك الخلايا البطانية.
الاستنتاجات
- يقوم هذا النموذج في المختبر بتكرار فعال لتدفق الدم الفسيولوجي والمرضي.
- تساهم النتائج في فهم استجابات الخلايا البطانية في أمراض الأوعية الدموية.
- يمكن تطبيق المنهجية على دراسات أخرى في بيولوجيا الأوعية الدموية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This in vitro flow model enables mechanistic de-risking of vascular targets by simulating physiological and pathological hemodynamics. It supports target validation through controlled modulation of pulsatility index to probe endothelial and smooth muscle cell responses. The system enhances predictive confidence in preclinical vascular research by linking flow dynamics to cytokine release and cross-talk mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by isolating flow as an independent variable in vascular cell remodeling.
- Operational Value: Enables reproducible assessment of cell morphology and protein expression under defined flow conditions.
- Scientific Value: Supports functional target validation by linking hemodynamic stress to cytokine release and cell-type cross-talk.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated co-culture systems for downstream compound screening in vascular disease models.
- Operational Value: Standardizes flow exposure via pressure damping chamber tuning for consistent pulsatility index control.
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements (morphology, actin/myosin expression) for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant shear stress to study vascular cell remodeling in stenosis or hypertension contexts.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via tunable flow pathologies.
- Scientific Value: Addresses risk-adjusted advancement by identifying flow-dependent hypertrophy and contractility markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target engagement to lead optimization by providing hemodynamic context for vascular phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of flow-dependent pathways in endothelial dysfunction and vascular remodeling.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cell responses under controlled pulsatile and steady flow conditions.
- Analytics: Enables quantitative comparison of cell morphology and protein expression across flow profiles using imaging and staining.
- Translational Research: Connects hemodynamic stimuli to preclinical relevance through co-culture models reflecting arterial wall interactions.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular flow platform adaptable to multiple vascular cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by de-risking vascular targets through hemodynamic mechanism elucidation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via calibrated damping chamber and indexed flow waveforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing flow-dependent contractility and hypertrophy phenotypes early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vascular targets based on flow-responsive protein expression thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vascular cell culture and hemodynamic flow system setup.
- Depends on precision fluid handling, pressure damping chambers, and ultrasonic flow metering.
- Necessitates cross-team standardization of pulsatility index protocols for comparative studies.
- Involves adaptation considerations when extending to smooth muscle fibroblasts or co-culture configurations.
- Limited by approximation of complex physiological pulse waveforms, which may affect translational fidelity.
![تطوير وتوصيف في المختبر شبكة Microvessel والقياسات الكمية من غشائي [كا 2+] ط والنيتريك إنتاج أكسيد](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-07-07T20%253A58%253A27.244Z&w=384&q=75)
