تعطيل المضادة للضراوة من الممرضة الأغشية الحيوية باستخدام المهندسة النصاب القانوني-التبريد Lactonases

الهدف العام من هذه التجربة هو إثبات فعالية إنزيمات تبريد النصاب في اضطراب الأغشية الحيوية البكتيرية. ستساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العلاجات المضادة للبكتيريا ، وللمساعدة في فهم تأثير اللاكتونازات التي تروي النصاب على البكتيريا المسببة للأمراض في بيئة الأغشية الحيوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إضافة اللاكتونازات المروية للنصاب مباشرة في بيئة في المختبر.

وبالتالي ، فإن تأثيره على اضطراب الأغشية الحيوية يمكن قياسه بسهولة. يوضح هذا الإجراء تيرينس تاي ، فني في مختبرنا. للبدء ، قم بزراعة 5 ملليلتر من A.baumannii S1 في LB عند 30 درجة مئوية في حاضنة اهتزازية لمدة 16 ساعة.

اضبط الثقافة على OD 600 من 0.8. ثم استخدم LB الطازج الذي يحتوي على 4 ملليغرام لكل ملليلتر من إنزيم GKL المنقى لتخفيف المزرعة من واحد إلى 100. وأضف 100 ميكرولتر إلى آبار صفيحة 96 بئرا.

استخدم الأغطية لتغطية الأطباق وضعها في وعاء بلاستيكي سعة 10 لترات. أغلق الحاوية واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات ، قبل إزالة الوسط برفق. أضف 100 ميكرولتر أخرى من وسط LB الطازج إلى الآبار ، واحتضن اللوحة عند 30 درجة مئوية لمدة 21 ساعة.

بعد إزالة الوسط برفق ، استخدم 200 ميكرولتر من الماء المعقم لغسل خلايا بكتيريا العوالق برفق. ضع طرف الماصة في قاع البئر وقم بإزالة الوسط السائل بعناية لضمان الحد الأدنى من الاضطرابات على الأغشية الحيوية الغريبة بين الهواء وواجهة السائل. ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول البنفسجي الكريستالي 1٪ إلى كل بئر ، واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة محلول البنفسج البلوري باستخدام 200 ميكرولتر من الماء المعقم لغسل الآبار ثلاث مرات. أضف 100 ميكرولتر من حمض الخليك بنسبة 33٪ إلى كل بئر واحتضن مع رج لطيف لمدة 15 دقيقة لإذابة الصبغة. قم بقياس كمية الأغشية الحيوية عن طريق قياس امتصاص البنفسج البلوري عند 600 نانومتر.

تتناسب كمية البنفسج البلوري مع كمية الأغشية الحيوية المتكونة. لإجراء الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر متحد البؤر ، أو CLSM ، للأغشية الحيوية A.baumannii S1 ، قم بزراعة ثقافة خمسة ملليلتر من A.baumannii S1 في LB عند 30 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز لمدة 16 ساعة. اضبط ثقافة A.baumannii S1 على OD 600 من 0.8.

ثم استخدم LB الطازج الذي يحتوي على 1.2 ملليغرام لكل مليليتر من إنزيم GKL المنقى لتخفيف المزرعة ، واحد إلى 100 ، وأضف ملليلتر واحد إلى 35 ملليلتر من دقيق القاع الزجاجي. غطي الطبق الدقيق بغطاء وضعيه في وعاء بلاستيكي سعة 10 لترات وأغلقيه قبل احتضان الطبق على حرارة 30 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد إزالة الوسط برفق ، أضف مليلا واحدا من الوسط الطازج الذي يحتوي على 30 ميكرولترا من إنزيم GKL المنقى ثم احتضنه عند 30 درجة مئوية لمدة 21 ساعة أخرى.

قم بإزالة الوسط برفق مرة ثانية واستبدله بملليلتر آخر من إنزيم GKL في وسط جديد. احتضان 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط برفق وأضف 500 ميكرولتر من خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من Alexa Fluor 488 agglutinin جرثومة القمح المترافقة المذاب في HBSS.

احتضن الطبق الدقيق عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتلطيخ الأغشية الحيوية. لإصلاح الأغشية الحيوية ، أضف 500 ميكرولتر من 3.7٪ فورمالديهايد المذاب في HBSS واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. استخدم ملليلترين من HBSS لغسل الطبق الدقيق مرة واحدة ، ثم قم بإزالة المحلول تماما.

قم بتخزين الطبق في الظلام عند أربع درجات مئوية قبل تصوير CLSM. لتصوير وتحليل CLSM، استخدم هدف 63X لإنشاء 97 مكدسا لكل صورة بفاصل زمني يبلغ 0.21 ميكرون لكل مكدس. في تجربة القياس الكمي للبنفسج البلوري ، تم استخدام GKL من النوع البري وإنزيم التبريد المجسم المزدوج المتحولة GKL لنشاط اللاكتوناز ضد ثلاثة هيدروكسي ديكانويل ل هوموسيرين لاكتون أو 3OHC10HSL ، جزيء النصاب الرئيسي الذي يستخدمه A.baumanii S1.As موضح هنا ، كان كلا الإنزيمين قادرين على تقليل تكوين الأغشية الحيوية بشكل كبير في النوع البري A.baumanii S1 المعالج مسبقا. لا يتناسب مدى اضطراب الأغشية الحيوية بواسطة كلا الإنزيمين مع فعاليتهما ضد 3OHC10HSL.

كما هو موضح في هذا الجدول ، فإن معدل دوران GKL المتحور أسرع بست مرات من النوع البري GKL مقابل 3OHC10HSL. ومع ذلك ، فإن الفرق في مدى اضطراب الأغشية الحيوية بين الإنزيمات ذو شقين فقط. في هذه التجربة ، تم استخدام إنزيم GKL المتحور المحسن وإنزيمه غير النشط للمقارنة.

تظهر صورة DIC هذه أن العلاج بإنزيم GKL المتحور المحسن أدى إلى انخفاض في حجم الأغشية الحيوية مقارنة بالإنزيم غير النشط. كشف تحليل الصور الفلورية أيضا أن هناك انخفاضا في مساحة السطح والكتلة الحيوية ومتوسط سمك الأغشية الحيوية ، عند معالجتها بإنزيم GKL المتحور المحسن. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات باستثناء وقت الحضانة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تقليل إزالة الأغشية الحيوية وتعطيلها أثناء خطوات الغسيل. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل عد الخلايا وفحوصات استقرار الإنزيم. سيجيب هذا على أسئلة إضافية مثل تأثيرات اللاكتونازات المروضة للنصابات على خلايا الخلايا داخل الأغشية الحيوية بالإضافة إلى مدة عملها.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علاج الأمراض المعدية لاستكشاف تأثيرات اللاكتونازات المحتملة لإخماد النصاب في الأغشية الحيوية التي تنتجها البكتيريا المسببة للأمراض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد اضطراب الأغشية الحيوية عن طريق تلطيخ البنفسج البلوري ، وتقييم التغيرات المورفولوجية في الأغشية الحيوية عن طريق التصوير متحد البؤر. لا تنس أن العمل مع المواد المسببة للأمراض يمكن أن يكون خطيرا للغاية.

يجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل استخدام مرافق احتواء المخاطر البيولوجية المناسبة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.