جيل من مجاميع من الفأر الخلايا الجذعية الجنينية التي تظهر التماثل يكسر، الاستقطاب والسلوك الجماعي الناشئ

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إنتاج تجمعات منتظمة من الخلايا الجذعية الجنينية للفئران والتي تخضع للتنظيم الذاتي والاستطالة المحورية والزراعة المعلقة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم الأحياء النمائي، مثل دور التفاعلات النسيجية في تحديد المحاور والتنظيم الذاتي في عمليات مثل التمايز الجنيني. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بدراسة الأحداث النمائية من منظور تفكيكي جديد خارج الجنين قبل عملية التجميع.

يتم الحفاظ على الخلايا الجنينية للفئران أو M MECs في وسط ES.Lift داخل دوارق زراعة أنسجة معالجة بمساحة 25 سنتيمتر مربع مطلية بالجيلاتين من أجل توليد التجمعات الخلوية. ابدأ بدورق زراعة الأنسجة الذي يحتوي على خلايا بنسبة تلاقي تتراوح من 40 إلى 60%، ثم اسحب الوسط واشطف الدورق مرتين باستخدام PBS، ثم أضف 1 مل من trypsin EDTA بتركيز 0.25% واحضن الدورق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبًا لفصل الخلايا عن جدار الدورق.

بعد ذلك، أضف خمسة مليلتر من وسط Es.Lift إلى معلق الخلايا المنفصلة واخلطه جيداً. انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مليلتر وخذ عينة مقدارها واحد مليلتر لعد الخلايا. أضف 5 × 10⁴ من الخلايا إلى خمسة مليلتر من محلول PBS الدافئ، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً عند 170 ×g لمدة خمس دقائق.

قم بشفط المحلول دون تعريض الرواسب للاضطراب. ثم أضف 5 mL من PBS برفق وكرر عملية الطرد المركزي. اشفط أكبر حجم ممكن من السائل دون تعريض رواسب الخلايا للاضطراب.

لمنع انتقال بقايا PBS، أعد تعليق كتلة الخلايا في 1 ml من وسط N2B27 الدافئ. اخلط جيداً باستخدام ماصة P1000 للحصول على معلق خلوي متجانس.

ثم قم بتخفيفه بإضافة أربعة ملليلترات أخرى من وسط N two B 27. انقل معلق الخلايا إلى خزان معقم باستخدام ماصة متعددة القنوات. اخلط الخلايا جيداً وانقل 40 microliters من معلق الخلايا من الخزان إلى كل بئر في لوح ubo غير المعالج للزرع النسيجي.

طبق ذو 96 بئراً. يُستخدم طبق غير مخصص لاستنبات الأنسجة خصيصاً لتقليل التصاق الخلايا بالطبق. يتم تحضين الطبق في حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة للسماح بتجمع الخلايا بعد مرور 48 ساعة.

أخرج الطبق من الحاضنة وافحص الخلايا باستخدام مجهر مقلوب للتأكد من وجود التجمعات. أضف حجماً من المحلول المخزني CHI 9 9 0 2 1 بتركيز 10 millimolar إلى وسط N two B 27 الدافئ لتحقيق تركيز نهائي قدره 3 micromolar. يمثل هذا الوسط الثانوي لتحفيز الخلايا.

استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع 150 µL من الوسط الثانوي في كل بئر. ابذل قوة كافية لإزالة أي تجمعات ملتصقة. أعد الطبق إلى حاضنة المزارع الخلوية لمدة 24 ساعة بعد فترة التحضين.

قم بإزالة الوسط بعناية دون شفط التجمعات الخلوية. أضف 150 µL من N2B27 الطازج إلى كل بئر بقوة كافية لإزاحة أي تجمعات ملتصقة. كرر هذه العملية كل 24 ساعة لفترة حضانة إجمالية تصل إلى خمسة أيام تقريباً.

لتحضير التجمعات الخلوية للتثبيت، ابدأ أولاً بسحب محلول الحضن برفق من كل بئر مع إمساك الماصة بزاوية 30 درجة. ولمنع سحب التجمع الخلوي، أضف 150 µL من PBS إلى كل بئر. انتظر لبضع دقائق حتى يستقر التجمع في القاع، ثم قم بسحب PBS.

كرر خطوة الغسيل هذه مرتين إضافيتين باستخدام مقص معقم. اقطع طرف ماصة P 1000 على ارتفاع ثلاثة مليمترات تقريبًا فوق فوهة التوزيع. اختم العملية باستخدام هذا الطرف، حيث يتم سحب كمية صغيرة من السائل بالماصة ثم تحريرها في البئر.

لتحريك التجمع وفكه من قاع البئر. ثم يتم سحب التجمع إلى الطرف ونقله إلى وعاء تشريح زجاجي لذبابة الدروزيلا. باستخدام نفس الإجراء، يتم جمع كافة التجمعات التي ستخضع لإجراءات صبغ مناعي متماثلة في وعاء تشريح واحد.

ضع وعاء التشريح تحت المجهر وحركه بشكل دائري لتحريك التجمعات نحو المركز. بعد ذلك، قم بشفط الـ PPS بعناية من حافة الوعاء، مع الحرص على عدم إزالة أي من التجمعات.

لتثبيت التجمعات، أضف 1 mL من محلول formaldehyde بتركيز 4% المُحضّر حديثاً، واحضن الأطباق في هزاز مداري لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 °C. اضبط الجهاز على سرعة منخفضة. اشفط محلول formaldehyde بعناية لمنع سحب أي من التجمعات، ثم أضف 1 mL من PBS إلى البئر.

أعِدِ الطبق إلى الهزاز المداري لمدة 10 minutes. قم بإزالة PBS من البئر وكرر خطوة الغسل هذه مرتين إضافيتين. بعد ذلك، أضف 1 mL من محلول P-B-S-F-T وضع الطبق على الهزاز المداري لمدة 10 minutes.

اشفط المحلول وكرر عملية الغسيل مرتين إضافيتين. أضف 1 mL من P-B-S-F-T لكل بئر لحجب التجمعات عن التفاعل المناعي غير النوعي. ضع اللوحة على الهزاز المداري بسرعة منخفضة لمدة ساعة واحدة عند 4 °C.

بعد انتهاء فترة الحضن، اسحب محلول الحجب بعناية من الآبار وأضف 500 µL من الجسم المضاد الأولي المخفف في P-B-S-F-T. قم بتغطية الطبق باستخدام البارافورم لمنع التبخر، ثم احضنه طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C على هزاز مداري بسرعة منخفضة. بعد ذلك، استبدل محلول الجسم المضاد الأولي بمحلول P-B-S-F-T المبرد مسبقاً.

اغسل التجمعات بوضع الطبق على الهزاز المداري. اضبط الجهاز على سرعة منخفضة عند درجة حرارة 4 °C لمدة خمس دقائق. كرر عملية الغسل مرة أخرى.

أجرِ دورتي غسيل إضافيتين باستخدام P-B-S-F-T عند درجة حرارة 4 °C وبسرعة منخفضة على الهزاز المداري. وكما هو موضح في البروتوكول النصي، قم بإزالة محلول الغسيل وتحضين العينة مع 500 µL من الجسم المضاد الثانوي المخفف في P-B-S-F-T. أضف 1 µg/mL من herst لتصوير النوى، ثم قم بالتحضين طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C على دوار جيراتي مع الحماية من الضوء.

أجرِ دورة غسيل أخرى باستخدام PBS FT عند درجة حرارة أربع درجات Celsius، مع الحماية من الضوء داخل صندوق ملفوف بورق القصدير. أجرِ عمليات غسيل إضافية باستخدام PBS يحتوي على 0.2%FBS و 0.2%Triton X 100 أو محلول PBT المنظم في درجة حرارة الغرفة. بعد سحب المحلول بعناية، قم بتحضين التجمعات مع 1 mL من خليط من الجلسرول إلى PBT بنسبة واحد إلى واحد لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، يتم تحضينها مع 1 mL من محلول الجلسرول بتركيز 7:3 مع PBT لمدة 30 دقيقة. ولتجهيز العينات للتصوير المجهري البؤري (confocal imaging)، يتم سحب محلول الجلسرول وPBT واستبداله بـ 1 mL من وسط التثبيت (mounting medium). ثم يتم تثبيت التجمعات في قطرات بحجم 17 µL على شريحة زجاجية.

باستخدام طرف ماصة، قم بتجهيز فاصل عن طريق طي قطعة من الشريط اللاصق مزدوج الوجه أربع مرات فوق نفسها. ثم ضع فاصلاً واحداً على كل جانب من التجمعات الموجودة على الشريحة، واقلب الغطاء، ثم مرره فوق الفواصل، وبعد ذلك قم بتصوير التجمعات باستخدام المجهر البؤري (confocal microscopy). بعد 48 ساعة من الزرع، تتشكل تجمعات يبلغ قطرها حوالي 150 micrometer وتظهر حدوداً ملساء.

من ناحية أخرى، قد تؤدي رداءة جودة الوسط، أو عدم مثالية عدد الخلايا عند الزرع، أو ضعف التصاق الخلايا إلى الفشل في التكتل بشكل صحيح. وتسبب المعالجة المستمرة لمدة 120 ساعة باستخدام CHI 9 9 0 2 1، وهو مثبط لإنزيم glycogen synthase kinase three، تحول التكتل الكروي إلى شكل مستطيل. كما يوجد تموضع متميز للخلايا الموجبة لـ SOX GFP عند أحد طرفي التكتل بعد المعالجة، وتؤدي المعالجات المختلفة إلى تغييرات مورفولوجية مختلفة في شكل التكتل الواحد وفي العلامة الفلورية.

يمكن تتبع التموضع داخل التجمع بمرور الوقت. وبمجرد إتقان هذه العملية، سيتمكن الباحث من إنتاج التجمعات في غضون 45 دقيقة تقريبًا إذا تم تنفيذ الخطوات بشكل صحيح. وبمجرد تشكل التجمعات، يمكن إجراء طرق أخرى مثل Q-R-T-P-C-R بدلًا من الصبغ المناعي لاستقصاء التغيرات في التعبير الجيني داخل التجمعات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تكوين التجمعات من خلايا MECs، وتطبيق محفزات محددة، وتجهيز التجمعات لصبغ المناعي وتحليل المجهر البؤري.