A السريع والكمية Fluorimetric طريقة لاستهداف البروتين جزيء صغير فحص المخدرات

يتمثل الهدف العام لطريقة الفحص الدوائي الفلورية الجديدة هذه في تحديد ألفة الارتباط لجزيئات الدواء الصغيرة ببروتين مستهدف، وذلك من خلال تكوين عناقيد نانوية ذهبية فلورية داخل القالب البروتيني المحمل بالدواء. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال اكتشاف الأدوية التي تستهدف البروتينات، مثل كيفية تأثير قوة ارتباط جزيئات الدواء على استقرار البروتينات ومنع تكشفها، مما يؤدي بدوره إلى تكوين عناقيد نانوية ذهبية فلورية بكثافات مختلفة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتنا على تحويل البروتين المستهدف إلى مستشعر حيوي فلوري، مما يتيح الفحص السريع للأدوية ذات الجزيئات الصغيرة دون الحاجة إلى أجهزة معقدة أو خطوات وسم مضنية.

إن الجمع بين معرفتي الخاصة واكتشاف المؤلفة المشاركة، التي قامت بتحميل البروتين، له تأثير تثبيت متميز على الجسيمات البلازمونية النانوية، وهو ما ألهم فكرة هذه الطريقة. ابدأ هذا الإجراء بتحضير الكواشف الكيميائية لفحص الأدوية كما هو مفصل في البروتوكول النصي؛ ولتحضير العناقيد الذهبية النانوية المعتمدة على قالب من ألبومين المصل البشري أو HSA، ضع قارورتين زجاجيتين تحتوي كل منهما على قضيب تحريك مغناطيسي دقيق على جهازين منفصلين للتحريك المغناطيسي مع إمكانية التحكم في درجة الحرارة.

اضبط درجة حرارة جهاز تحريك مغناطيسي واحد على 60 °C. بعد ذلك، أضف 200 µL من محلول ألبومين المصل البشري و200 µL من الماء فائق النقاء و200 µL من محلول كلوريد الذهب إلى كل أنبوبة تحت تحريك مستمر للسماح بتغليف أيونات الذهب داخل قالب البروتين، وبعد مرور دقيقتين، أضف 20 µL من محلول هيدروكسيد الصوديوم إلى كل أنبوبة لتنشيط قدرة ألبومين المصل البشري على الاختزال مما يؤدي إلى تكوين عناقيد الذهب النانوية. ابدأ بتسجيل وقت التفاعل عند الدقيقة صفر ثم كل 20 دقيقة.

اسحب 50 µL من كل عينة وانقلها إلى لوحة سوداء ذات 384 بئرًا. قم بقياس طيف الانبعاث باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة. أوقف التقليب المغناطيسي بعد 100 دقيقة.

قم بتبريد القوارير الزجاجية تحت مياه جارية في حوض الغسيل. قم برسم أطياف الانبعاث الضوئي باستمرار لكل عينة للحصول على حركية تكوين العناقيد النانوية الذهبية عند ظروف درجات حرارة مختلفة. لتحضير العناقيد النانوية الذهبية المعتمدة على قالب bovine serum albumin أو BSA، ضع قارورة زجاجية تحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي دقيق فوق جهاز التحريك المغناطيسي.

اترك درجة الحرارة عند درجة حرارة الغرفة. اخلط 200 µL من محلول BSA و200 µL من اليوريا و200 µL من محلول كلوريد الذهب في القارورة الزجاجية مع التقليب المستمر. بعد دقيقتين، أضف 20 µL من محلول هيدروكسيد الصوديوم.

لتنشيط القدرة المختزلة لـ BSA لتكوين عناقيد ذهب نانوية والبدء في تسجيل وقت التفاعل عند الدقيقة صفر. قم بقياس طيف الانبعاث الضوئي لخليط التفاعل كل ساعة. ضع خمس قوارير زجاجية تحتوي كل منها على قضيب تحريك مغناطيسي ومصنفة مسبقاً بدواء أو بـ HSA نقي فوق جهاز تحريك مغناطيسي متعدد النقاط قابل للتحكم في درجة الحرارة.

أضف 200 µL من HSA إلى كل قارورة. ثم أضف 1 µL من كل محلول دواء تم تحضيره مسبقاً إلى القوارير الأربع المقابلة. كذلك، أضف 1 µL من DMSO إلى عينة الضبط في جهاز التحريك.

اضبط سرعة الدوران على 360 RPM واترك العينة للحضن لمدة ساعة واحدة للسماح بارتباط الدواء بـ HSA، وبعد ساعة، أضف 200 microliters من ماء milli Q و200 microliters من محلول كلوريد الذهب إلى كل أنبوب مع التحريك المستمر. اضبط درجة الحرارة على 60 degrees Celsius مع التحريك المستمر لمدة 10 دقائق. بعد مرور 10 دقائق، أضف 20 microliters من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1.5 molar إلى كل أنبوب وابدأ في تسجيل وقت التفاعل عند الدقيقة صفر.

يجب أن تتبع محاليل التفاعل المشتركة المخصصة للقياس نفس تسلسل إضافة العقاقير، وينبغي تنفيذ ذلك بأسرع ما يمكن لتقليل تأثير الفارق الزمني. اسحب سريعاً 50 µL من المحلول من كل قارورة، وانقلها إلى لوح أسود ذي 384 بئراً، ثم قم بقياس طيف الانبعاث. سجل أطياف الانبعاث لكل عينة كل 10 دقائق، مع جمع أربعة أطياف على الأقل في أربعة أوقات مختلفة.

كرر هذه الخطوات عدة مرات للحصول على نتائج ذات اتجاه ثابت. قم برسم أطياف الانبعاث الضوئي ذات الدقة الزمنية لكل عينة. حدد شدة الذروة لجميع العينات وقم برسمها مقابل الزمن لمقارنة حركية تكوين العناقيد النانوية الذهبية في قوالب بروتينية مختلفة محملة بالأدوية لقياس ثابت الارتباط بين كل دواء و HSA.

استبدل محاليل الدواء بمحاليل ibuprofen بأربعة تركيزات مختلفة. وبعد مرور 10 دقائق، قم بتبريد القوارير الزجاجية تحت الماء الجاري في حوض الغسيل. اسحب 50 µL من المحاليل المذكورة أعلاه من كل قارورة إلى لوحة سوداء ذات 384 بئراً وقم بقياس طيف الانبعاث.

كرر هذه الخطوات مرتين إضافيتين للحصول على مجموعتين أخريين من النتائج بتركيزات مختلفة من العقار قبل إيقاف التقليب المغناطيسي. بعد ذلك، قم برسم أطياف الانبعاث الضوئي وتحليل النتائج الخام التي تم الحصول عليها في كل دفعة على حدة. ارسم أطياف الانبعاث الضوئي لكل عينة باستخدام برنامج مثل Origin Pro وحدد شدة الذروة.

قم بحساب ورسم شدة الفلورية النسبية مقابل تركيز الدواء. ثم احسب ثابت الارتباط عن طريق مواءمة البيانات مع نموذج ارتباط أحادي الموقع. استخدم معادلة Mics cementin للقيام بذلك في برنامج مثل Origin Pro.

اختر قائمة التحليل "fitting non-linear curve fit"، ثم اختر "hail function" من فئة النمو السيني "growth sigmoidal" في صفحة اختيار دالة الإعدادات. انقر فوق "fit" للعرض. النتائج المطابقة الموضحة هنا هي نتائج ممثلة لأطياف الانبعاث الضوئي ذات الدقة الزمنية لعناقيد الذهب النانوية التي تم إنتاجها في ظروف مختلفة من تمسخ البروتين.

يمكن ملاحظة أن العناقيد النانوية الذهبية تتكون بشكل أسرع عند درجات الحرارة المرتفعة. كما يمكن لظروف تمسخ اليوريا أن تسهل التخليق المباشر للعناقيد النانوية الذهبية باستخدام بروتين BSA كقالب. وتظهر هنا النتائج النموذجية للفحص الدوائي الفلوري السريع بناءً على شدة Fluorescence للعناقيد النانوية الذهبية باستخدام HSA المحمل بالدواء كقالب.

كلما زادت شدة الفلورة، ضعفت قوة ارتباط جزيء الدواء ببروتين HSA. توضح هذه الأطياف تأثير تركيز تحميل الدواء على معدل تكوين عناقيد الذهب النانوية الفلورية داخل بروتين HSA المحمل بالإيبوبروفين. كلما زاد تركيز الدواء، انخفضت إشارة الفلورة لعناقيد الذهب النانوية الناتجة، وما يظهر هنا هو نتيجة تمثيلية لتحديد ثابت ارتباط الدواء بالبروتين.

يتم حساب ذلك عن طريق مواءمة شدة الفلورة النسبية لعناقيد الذهب النانوية المُصنعة في قالب HSA المحمل مسبقاً بعقار الإيبوبروفين بتركيزات متنوعة باستخدام معادلة MICUs cementin. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إجراؤها في غضون 30 دقيقة لفحص عقاقير متعددة على التوازي إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية تصنيع عناقيد الذهب النانوية في البروتين المحمل بالعقار، وكيفية تحديد ألفة ارتباط العقاقير ببروتين مستهدف كما يمكن الكشف عنها من خلال إشارة الفلورة المنبعثة من عناقيد الذهب النانوية الناتجة.