A السريع والكمية Fluorimetric طريقة لاستهداف البروتين جزيء صغير فحص المخدرات

الهدف العام من طريقة فحص الأدوية المترية الفلورية الجديدة هو تحديد تقارب ربط جزيئات الدواء الصغيرة بالبروتين المستهدف عن طريق تكوين مجموعات نانو من الذهب الفلوري داخل قالب البروتين المحمل بالدواء. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البروتين الذي يستهدف اكتشافات الأدوية مثل كيف يمكن أن تؤثر قوة الفيديو لجزيئات الدواء على استقرار البروتينات من الظهور مما يؤدي إلى تكوين مجموعات نانو الذهب الفلوري ذات الشدة المختلفة. الميزة الرئيسية لهذا التنيكس هي أنه يمكننا تحويل هدف البروتين إلى مستشعر حيوي فلوري لتمكين الفحص السريع للأدوية الجزيئية الصغيرة دون الحاجة إلى أداة متطورة وخطوات وضع العلامات المملة.

إن الجمع بين معرفتي الخاصة بالإضافة إلى المؤلف المشارك ، اكتشفت أن لي حملت البروتين ، له تأثير استقرار مميز على البلازمون. ألهمت الجسيمات النانوية فكرة هذه الطريقة. ابدأ هذا الإجراء بإعداد الكواشف الكيميائية لفحص الأدوية كما هو مفصل في بروتوكول النص لتحضير ألبومين المصل البشري أو مجموعات النانو الذهبية النموذجية HSA ، ووضع قارورتين زجاجيتين تحتوي كل منهما على قضيب تحريك مغناطيسي دقيق على تحركتين مغناطيسيتين منفصلتين يمكن التحكم في درجة حرارتهما.

اضبط درجة حرارة التحريك المغناطيسي على 60 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من محلول ألبومين المصل البشري ، و 200 ميكرولتر من الماء عالي النقاء و 200 ميكرولتر من محلول كلوريد الذهب إلى كل قارورة تحت التحريك المستمر للسماح بتغليف أيونات الذهب داخل قالب البروتين ، بعد دقيقتين ، أضف 20 ميكرولترا من محلول هيدروكسيد الصوديوم إلى كل قارورة لتنشيط القدرة المختزلة لألبومين المصل البشري الذي يعلم مجموعات نانو الذهب. ابدأ في تسجيل وقت رد الفعل عند صفر دقيقة كل 20 دقيقة.

ارسم 50 ميكرولترا من كل عينة وانقلها إلى صفيحة سوداء 384 جيدا. قم بقياس طيف الانبعاث باستخدام قارئ صفيحة دقيقة. أوقف التحريك المغناطيسي بعد 100 دقيقة.

قم بتبريد القوارير الزجاجية تحت الماء الجاري في الحوض. ارسم أطياف انبعاث الصور في جميع الأوقات لكل عينة للحصول على حركية تكوين مجموعات الذهب النانوية في ظروف درجات حرارة مختلفة. لتحضير ألبومين مصل الأبقار أو مجموعات نانو الذهب النموذجية BSA ، ضع قارورة زجاجية تحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي دقيق في الجزء العلوي من التحريك المغناطيسي.

اترك درجة الحرارة كدرجة حرارة الغرفة. امزج 200 ميكرولتر من محلول BSA و 200 ميكرولتر من اليوريا و 200 ميكرولتر من محلول كلوريد الذهب في القارورة الزجاجية تحت التحريك المستمر. بعد دقيقتين في 20 ميكرولتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم.

لتنشيط قدرة الاختزال ل BSA على تكوين مجموعات نانو ذهبية والبدء في تسجيل وقت التفاعل على أنه صفر دقيقة. قم بقياس طيف الانبعاث الضوئي لخليط التفاعل كل ساعة. ضع خمس قوارير زجاجية تحتوي كل منها على قضيب تقليب مغناطيسي ومسمى مسبقا بدواء أو HSA نقي فوق تحريك مغناطيسي متعدد النقاط يمكن التحكم في درجة حرارته.

أضف 200 ميكرولتر من HSA إلى كل قارورة. ثم أضف ميكرولتر واحد من كل محلول دوائي معد مسبقا إلى الملفات الأربعة المقابلة. أيضا ، أضف ميكرولتر واحد من DMSO إلى مفتاح التحكم في التحريك r.

اضبط سرعة الدوران على 360 دورة في الدقيقة واحتضن لمدة ساعة واحدة للسماح للدواء بالارتباط ب HSA بعد ساعة واحدة عند 200 ميكرولتر من ماء مللي Q و 200 ميكرولتر من محلول كلوريد الذهب لكل قارورة تحت التحريك المستمر. اضبطي درجة الحرارة على 60 درجة مئوية تحت التحريك المستمر لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق عند 20 ميكرولتر من 1.5 مولي هيدروكسيد الصوديوم لكل ملف وابدأ في تسجيل وقت التفاعل عند الصفر دقيقة.

يجب أن تتبع حلول التفاعل المشترك للقياس نفس تسلسل إضافة الأدوية ويجب ممارستها في أسرع وقت ممكن لتقليل تأثير التأخر الزمني اسحب بسرعة 50 ميكرولترا من المحلول من كل قارورة. انقله إلى صفيحة سوداء 384 جيدا وقم بقياس طيف الانبعاث. سجل أطياف الانبعاث لكل عينة كل 10 دقائق ، مع جمع أربعة أطياف على الأقل في أربع أوقات مختلفة.

كرر هذه الخطوات عدة مرات للحصول على نتائج ذات اتجاه ثابت. ارسم أطياف انبعاث الصور التي تم حلها في الوقت لكل عينة. حدد كثافة الذروة لجميع العينات وارسم مع الوقت لمقارنة حركية تكوين مجموعات نانو الذهب في قوالب البروتين المختلفة المحملة بالأدوية لقياس ثابت الارتباط بين كل دواء و HSA.

استبدل المحاليل الدوائية بمحلول الإيبوبروفين بأربعة تركيزات مختلفة. بعد 10 دقائق ، قم بتبريد القوارير الزجاجية تحت الماء الجاري في الحوض. ارسم 50 ميكرولترا من المحاليل المذكورة أعلاه من كل قارورة إلى صفيحة سوداء 384 جيدا وقم بقياس طيف الانبعاث.

كرر هذه الخطوات مرتين أخريين للحصول على مجموعتين أخريين من النتائج بتركيزات مختلفة من الدواء قبل إيقاف التحريك المغناطيسي. ثم ارسم أطياف انبعاث الصور وحلل نتائج الخام الذي تم الحصول عليه في كل دفعة على حدة. ارسم أطياف انبعاث الصور لكل عينة في برنامج مثل Origin Pro وحدد شدة الذروة.

احسب وارسم شدة التألق النسبية مقابل تركيز الدواء. ثم احسب ثابت الربط عن طريق تركيب البيانات في نموذج ربط موقع واحد. استخدام معادلة الميكروفونات cementin للقيام بذلك في برامج مثل Origin Pro.

حدد تحليل القائمة المناسب لملاءمة المنحنى غير الخطي ، ثم حدد وظيفة البرد من فئة النمو السيني في صفحة تحديد وظيفة الإعدادات. انقر فوق ملاءمة للعرض. النتائج المجهزة الموضحة هنا هي نتائج تمثيلية لأطياف انبعاث الصور التي تم حلها في الوقت المناسب لمجموعات الذهب النانوية المنتجة في ظروف تغيير طبيعة البروتين المختلفة.

يمكن ملاحظته عند مجموعات النانو الذهبية التي تتشكل بشكل أسرع عند درجة حرارة أعلى. يمكن أن تسهل حالة تغيير طبيعة اليوريا أيضا التخليق المباشر لمجموعات الذهب النانوية باستخدام بروتين BSA كقالب. النتائج النموذجية للفحص السريع للأدوية المترية بالفلورو بناء على شدة التألق لمجموعات نانو الذهب باستخدام HSA المحملة بالمخدرات كقالب موضحة هنا.

كلما زادت شدة الفلورسنت ، زادت قوة ربط جزيء الدواء ب HSA. تظهر هذه الأطياف تأثير تركيز تحميل الدواء على معدل تكوين مجموعات نانو الذهب الفلورية داخل HSA المحمل بالإيبوبروفين. كلما زاد تركيز الدواء ، انخفضت إشارة الفلورسنت لمجموعات نانو الذهب الناتجة الموضحة هنا وهي نتيجة تمثيلية لتحديد ثابت ربط دواء البروتين.

يتم حسابه عن طريق تركيب شدة التألق النسبية لمجموعات الذهب النانوية المركبة في قالب HSA المحمل مسبقا بعقار الإيبوبروفين بتركيزات متنوعة باستخدام معادلة الأسمنت MICUs بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 30 دقيقة لفحص الأدوية المتعددة بالتوازي إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية توليف العنان ، والانتقال إلى مجموعة النانو في البروتين المحمل بالدواء ، وتحديد تقارب ارتباط الأدوية بالبروتين المستهدف كما يمكن اكتشافه بواسطة إشارة الفلورسنت المنبعثة من مجموعات النانو الذهبية الناتجة.