باستخدام السابقين فيفو الثقافات تستقيم القطرة من الجامعة الجنين هيئات لدراسة العمليات التنموية خلال الماوس توالد

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص تأثيرات مثبطات الجزيئات الصغيرة على نمو أعضاء الجنين باستخدام تقنية زراعة القطيرات خارج الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق فتح الصفاق أولا للفأر الحامل وإزالة الجنين المحتوي على الرحم. بعد ذلك ، تتم إزالة الأجنة من الرحم ويتم تحريرها من صفار البيض والأكياس الأمنيوسية.

ثم يتم تشريح مركب goad me neph وعزله عن الجنين. أخيرا ، يتم زراعة مركب goad Meris في قطرة مع أو بدون مثبط جزيء صغير. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري المناعي لإظهار التغييرات في بنية الأعضاء باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بنوع الخلية.

لذا فإن ميزة ثقافة القطرات المستقيمة للعضو بأكمله خارج الجسم الحي مقارنة بخطوط زراعة الخلايا ، هي أنها تتمتع بميزة وجود بنية ثلاثية الأبعاد تؤدي إلى تفاعلات خلوية بسبب الموقع ، بالإضافة إلى إشارات الأم خارج الخلية التي قد تكون مهمة لتكوين الأعضاء والزخرفة. علاوة على ذلك ، تسمح تقنية القطرات المستقيمة لدينا باستخدام كواشف أقل ، وبالتالي تقليل التكلفة والسمية المحتملة بسبب الآثار الجانبية. هذه ميزة على تقنيات الأعضاء الكاملة الأخرى ، ولا تزال تسمح بنشر العوامل الدوائية إلى العضو المستهدف.

على الرغم من أن هذه التقنية يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتطور الأوعية الدموية في خصيتين الجنين ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أعضاء الجنين الأخرى مثل الرئة ، ويمكننا أيضا استخدامها للتحقيق في العمليات البيولوجية المتنوعة. هناك مسارات أخرى لإشارات الخلية أثناء نمو الجنين في E 11.5. بعد القتل الرحيم للفأر الحامل ، وفقا للنص ، استخدم 70٪ من الإيثانول لرش البطن بمقص ناعم.

قم بعمل شق على شكل حرف V لفتح جلد البطن والصفاق وسحب سديلة الأنسجة للخلف لكشف الأعضاء الأمامية. حدد موقع المبايض على طرفي القرن الرحمي ، ثم بقطع المقص عند المبيض والنسيج الضام لفصل الرحم الذي يحتوي على الأجنة عن جسم الأم. بعد ذلك ، افتح جدار الرحم عن طريق قطع الجانب المقابل للمشيمة برفق ، وتعريض أكياس الصفار.

احرص على عدم ثقب كيس الصفار لتجنب إتلاف الأجنة أو فقدانها. ثم اقطع بالقرب من المشيمة لإزالة الجنين الذي يحتوي على أكياس صفار البيض ووضعها في طبق يحتوي على PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم ، مما سيساعد على دعم جزيئات التصاق الخلايا للحفاظ على بنية الأنسجة ومنع الأنسجة من الالتصاق بالأدوات باستخدام الملقط ، قم بإزالة كيس الصفار والسلى من الجنين عن طريق ثقب كيس الصفار بعناية لإنشاء ثقب يمكن للجنين أن ينزلق فيه. بمجرد أن يكون الجنين خارج كيس الصفار ، اقطع الحبل السري.

من هذه النقطة فصاعدا ، استخدم مجهرا موجودا في غطاء مزرعة الأنسجة المعقمة. قم بإزالة رأس الجنين باستخدام ملقط للضغط على جانبي الرقبة ، وتخلص من الرأس ، وإزالة الذيل ، ووضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد لتحليل X-Y-P-C-R لتحديد جنس الجنين. الآن قم بتأمين الجنين في وضع ضعيف مقابل قاع طبق المزرعة باستخدام زوج من الملقط لتثبيت إبطين الجنين بزوج آخر من الملقط.

قم بإزالة الجلد الذي يغطي البطن وإزالة الكبد والأمعاء والأعضاء الأخرى برفق لكشف جدار الجسم الخلفي حيث توجد حافة الجهاز البولي التناسلي. استخدم الملقط للغرف تحت حافة الجهاز البولي التناسلي عن طريق فتح الملقط بعناية ورفعه. قم بإزالة حافة الجهاز البولي التناسلي.

احرص على عدم التسبب في تلف الغدد التناسلية. انقل حافة الجهاز البولي التناسلي إلى طبق C-D-M-E-M لتأقلم الأنسجة مع الوسط باستخدام 27 إبرة قياس لفصل مركب الغدد التناسلية Sphs عن بقية الجسر البولي التناسلي. استخدم إبرة واحدة للقطع بالضغط لأسفل والأخرى لتوجيه الأنسجة بشكل صحيح للسماح بالفصل الأمثل للثقافة.

قام الغدد التناسلية مع مثبط جزيئي صغير بضبط ماصتين سعة 20 ميكرولتر على 15 ميكرولتر لكل منهما باستخدام شفرة حلاقة نظيفة ومعقمة. اقطع حوالي ملليمتر إلى ملليمترين من أحد أطراف الماصة الحاجزة لنقل الغدد التناسلية وإضافة التحكم C-D-M-E-M. قم بمحاذاة الغدد التناسلية بمحورها الطويل الموازي لطرف الماصة بحيث يمكن ماصتها بسهولة بطرف قطع قم بتسمية جانب واحد من غطاء الطبق مقاس 35 ملم على أنه قطرة التحكم والآخر على أنه الدواء الذي يحتوي على قطرة.

تأكد من أن الملصقات الموجودة على الأغطية تتطابق مع الملصقات الموجودة على أنسجة الذيل التي تحتوي على أنابيب طرد مركزي دقيقة. ماصة 15 ميكرولترا من C-D-M-E-M تحتوي على غدد تناسلية واحدة في قطرة في الغطاء. مع الحرص على عدم التصاق الغدد التناسلية بالجزء الداخلي من طرف الماصة وتكرارها مع القطرة الثانية على الجانب الآخر.

تحقق تحت المجهر من نقل الغدد التناسلية إلى القطرة المعينة كعنصر تحكم. استخدم ماصة التحكم لإضافة 15 ميكرولترا إضافيا من C-D-M-E-M المحتوية على DMSO للوصول إلى قطرة 30 ميكرولتر إلى القطرة الأخرى. استخدم الماصة المخصصة للأدوية لإضافة 15 ميكرولترا من TKI اثنين في C-D-M-E-M باستخدام الماصة.

انشر القطرات في نمط دائري متوسع حتى يبلغ قطرها حوالي 15 إلى 18 ملم ويقع الغدد التناسلية تقريبا في المنتصف. قم بتوجيه الغدد التناسلية بحيث تقع على جانبها ويمكن تمييز الغود والميسين بسهولة. قم بتوجيه الرئتين بحيث يكون الفصان مسطحين ويتم تثبيتهما في مكانهما بسبب التوتر السطحي مع عدم لمس بعضهما البعض.

ضع غطاء طبق الاستزراع بحذر مع وضع القطرات في وضع مستقيم ووضعها بشكل مسطح على سطح الماء في طبق ترطيب كبير ، مع التأكد من عدم وجود فقاعات محاصرة تحتها وعدم دخول الماء إلى الغطاء. لإنشاء غرفة صغيرة مرطبة ، قم بتغطية الطبق الكبير على الفور بغطاءه ، مما يضمن أن أغطية الأطباق الصغيرة قادرة على التحرك بحرية في الطبق الأكبر ويمكن أن يحدث تبادل الهواء. بمجرد وضع الغطاءين الصغيرين في الغرفة ، ضع الغرفة على الفور في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.

إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل والتألق المناعي وفقا لبروتوكول النص. عند استزراعها باستخدام نظام زراعة القطرات Exvivo ، تتمتع مجمعات جنين sphs بمعدل بقاء مرتفع كما هو موضح هنا. تكشف مقارنات الغدد التناسلية E 11.5 في الحضانة الأولية مقابل 24 أو 48 ساعة في الثقافة عن تغيير جذري في شكل الغدد التناسلية وظهور هياكل الشريط مثل الحبل في الغدد التناسلية XY للتحكم كما هو موضح هنا.

يمكن لنظام زراعة القطرات إعادة إنشاء أحداث تمايز الخصية خارج الجسم الحي حيث من الممكن تصور SOX تسع خلايا سيرتولي موجبة في الغدد التناسلية XY التي تتشكل في أنبوب مثل الحبال والأوعية الدموية التي تتشكل في جميع أنحاء العضو. في الرئتين ، تؤدي زراعة 48 ساعة إلى زيادة تفرع SOX تسعة فروع ظهارية موجبة مزدوجة من البيئ. في حين أن هناك بعض الزيادة في الخلايا موت الخلايا المبرمج في الرئتين ، في نفس ظروف الثقافة ، تظهر مستويات مماثلة من موت الخلايا المبرمج في التحكم المزروع وفي الرحم.

الغدد التناسلية التي تشير إلى أن الغدد التناسلية قابلة بشكل خاص لظروف الثقافة. لفحص آثار الأوعية الدموية وإعادة تشكيل الأوعية الدموية في تشكل الخصية ، تم استخدام مثبط الجزيء الصغير TKI two ، الذي يمنع نشاط مستقبلات VEGF. توضح النتائج أن تعطيل إعادة تشكيل الأوعية الدموية في خصية الجنين فعال في نظام زراعة القطيرات ، ويمكن تصور العيوب اللاحقة في تشكل حبل الخصية باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي أو تسلسل الحمض النووي الريبي من الجيل التالي أو قياس التدفق الخلوي للإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية تأثير الكواشف الدوائية المختلفة على التعبير عن البروتين أو الجينات ذات الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا استخدام التصوير المباشر بفاصل زمني لتصور الديناميكيات الخلوية في الوقت الفعلي إذا تم استخدام أجنة الفلورسنت المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى ذلك ، تتوفر مجموعة واسعة من الكواشف لاستهداف مسارات الإشارات المرشحة التي قد تكون متورطة في تكوين الأعضاء الجنينية.

ستساعدنا هذه التقنيات على فهم الآليات الأساسية التي تدفع نمو الجنين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على إجراء مزارع قطرات مستقيمة للعضو بالكامل خارج الجسم الحي من أجل توضيح مسارات الإشارات أثناء تكوين الأعضاء في الجنين. تتضمن هذه التقنية تشريح أجنة منتصف الحمل ، وعزل الأعضاء المستهدفة ، وإعداد مزارع القطرات المستقيمة لحضانة هذه الأعضاء باستخدام الكواشف الصيدلانية.