تقييم خصائص المناعية للالوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية (اللجان الدائمة)

الهدف العام من هذه التجربة هو تقييم الخصائص المناعية للخلايا الجذعية الوسيطة البشرية أو MSC. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توضيح الآليات التي ينطوي عليها التعديل المناعي للخلايا الجذعية الوسيطة البشرية ، وهي عملية قد يكون لها أهمية علاجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تقييم كل من حدوث المستجيب وتكاثر الكريات البيض وعدد انقسامات الخلايا مما يدل على أن الإجراء سيكون لكل حذاء.

فني من مختبري لعزل pbmc ابدأ بتخفيف 25 مل من عينة دم كاملة هيبارين مع 25 مل من PBS في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. بعد ذلك ، أضف 15 مل من phi ، واستدعاء تدرج كثافة العبوة إلى أنبوب جديد سعة 50 مل. ثم أمسك الأنبوب بزاوية بطبقة ببطء من تعليق الخلية المخفف فوق تدرج الكثافة.

مع الاعتناء بذلك ، لا يوجد خلط للطبقات. واحدة من أهم الخطوات في هذه التجربة هي وضع طبقات من الدم دون الإخلال بتدرج الكثافة. هذا لضمان نقاء عال وتلوث خلايا الدم الحمراء المنخفضة ل pbmc المعزول.

الآن ، افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي. يجب أن تكون ثلاث طبقات مميزة واضحة. طبقة البلازما العليا ، وطبقة تدرج كثافة العبوة السفلية ، وطبقة PBMC متوسطة رقيقة.

باستخدام ماصة البولي إيثيلين ، قم بإزالة الطبقة العليا مع الحرص على عدم شفط طبقة الطور البيني. ثم استخدم ماصة سعة 10 ملليلتر لنقل pbmc بعناية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. امزج الخلايا مع 20 مل من PBS ثم قم بتدويرها لإزالة أي آثار لتدرج الكثافة.

ثم اغسل الحبيبات في 20 مل أخرى من PBS لإزالة الصفائح الدموية. تعليق الحبيبات الثانية في وسط الكريات البيض الكامل عند واحد في 10 من الخلايا السابعة لكل تركيز مليلتر. لإعداد التسخين المسبق للزراعة المشتركة لكريات الدم البيضاء MSC ، أكمل متوسط MSC إلى 37 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة.

ثم قم بالبذور خمسة أضعاف 10 إلى رابع MSC لكل مليلتر واحد من وسط MSC الكامل لكل بئر في 24 لوحة بئر للتعلق طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، مما يسمح للخلايا بالوصول إلى 80٪ من التقاء. في صباح اليوم التالي ، استنشق الوسط وأضف العدد المناسب من CFSE المسمى P BMCs إلى MSC في مليلتر واحد من وسط الكريات البيض الكامل. بنسبة واحد إلى 10 MSC إلى PBMC ، قم بتنشيط الخلايا ب 10 ميكروغرام من PHA لكل مليلتر من وسط الكريات البيض الكامل.

ثم في اليومين الثالث والخامس من الزراعة المشتركة ، انقل العدد المناسب من الزراعة المشتركة إلى أنابيب الفاكس السفلية المستديرة وتقييم تكاثر الكريات البيض المسماة CFSE عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي لإجراء اختبار قمع المستجيب. ابدأ بإنشاء ثقافة مشتركة M-S-C-P-B-M-C كما هو موضح للتو مع 2.5 في 10 إلى سادس p BMCs الزراعة المشتركة مع 250,000 MSCs. لضمان ما يكفي من MSC للاستزراع المشترك p BMCs لاختيار السكان الفرعيين.

بعد 48 إلى 72 ساعة عند 37 درجة مئوية ، حدد الكريات البيض المعدلة للمناعة المستحثة من MSC ذات الأهمية مع الخرز المغناطيسي المناسب. ثم أضف CFSE المسمى CD الخيفي أربع خلايا تائية موجبة في مليلتر واحد من وسط الكريات البيض الكامل لكل بئر بنسب تجريبية مختلفة. بعد ذلك ، أضف الميكروبيدات المترافقة المضادة للقرص المضغوط 3 28 بنسبة B إلى الخلية لتحفيز الخلايا التائية الأربعة الإيجابية للقرص المضغوط

في اليوم الثالث من الزراعة المشتركة ، قم بتقييم تكاثر الخلايا التائية الموجبة ل CFSE المسمى أربع خلايا تائية موجبة عن طريق قياس التدفق الخلوي الخلايا الجذعية الجذعية هي خلايا ملتصقة ذات مورفولوجيا على شكل أعمدة ليفية على شكل مغزل. و pbmc و leukocytes عبارة عن خلايا صغيرة مستديرة غير ملتصقة ، مما يسمح بالتمييز الواضح بين هاتين المجموعتين من الخلايا. في الثقافة المشتركة ، عندما لا يكون هناك انتشار ، لوحظ أن الخلايا المسماة CFSE هي ذروة إيجابية للغاية وفلورية حادة عندما يتم تنشيط الخلايا.

يتجلى الانتشار في شكل قمم أصغر متعددة مع فقدان وتحول إلى اليسار في شدة التألق عند حدوث قمع الانتشار. على سبيل المثال ، في الثقافة المشتركة ل MSC ، تنخفض القمم الأصغر المتعددة في العدد مع زيادة مصاحبة في شدة التألق كما يتضح من تحول القمم إلى اليمين وزيادة حدة الذروة الموجودة في أقصى اليمين ، والتي تمثل الخلايا غير المنقسمة في مقايسة قمع المستجيب. يمكن تقييم التأثير القمعي ل MSC على تكاثر الخلايا التائية الإيجابية الأربعة بطريقة تعتمد على الجرعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك معرفة جيدة بكيفية تقييم التعديل المناعي للخلايا الجذعية الوسيطة البشرية. لا تنس أن العمل مع الخلايا البشرية يمكن أن يكون خطيرا وأنه يجب دائما اتخاذ الاحتياطات.