تقييم خصائص المناعية للالوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية (اللجان الدائمة)
ديسمبر 24, 2015
تظهر الخصائص المناعية للخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) ذات الصلة على نحو متزايد عن التطبيق السريري. باستخدام نظام المشاركة في ثقافة اللجان الدائمة والكريات البيض في الدم الطرفية ملطخة مسبقا مع صبغة الفلورسنت carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE)، وصفنا التقييم في المختبر من MSC المناعة على انتشار المستجيب الكريات البيض ومجموعات سكانية فرعية محددة.
الهدف العام من هذه التجربة هو تقييم الخصائص المعدلة للمناعة للخلايا الجذعية الميزنكيمية البشرية أو msc. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توضيح الآليات المشاركة في التعديل المناعي للخلايا الجذعية الميزنكيمية البشرية، وهي عملية قد تكون ذات أهمية علاجية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي إمكانية تقييم كل من حدوث تكاثر الكريات البيضاء المؤثرة وعدد انقسامات الخلايا، مما يثبت أن الإجراء سيكون دقيقاً.
لعزل خلايا pbmc، يقوم فني من مختبري ببدء العملية بتخفيف 25 milliliters من عينة دم كامل مضاف إليها الهيبارين باستخدام 25 milliliters من PBS في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. بعد ذلك، يتم إضافة 15 milliliters من phi, call pack density gradient إلى أنبوب جديد سعة 50 milliliter. ثم مع إمالة الأنبوب بزاوية، يتم وضع معلق الخلايا المخفف ببطء فوق تدرج الكثافة.
من خلال مراعاة ذلك، لن يحدث اختلاط بين الطبقات. وتعد عملية ترسيب الدم دون تعكير تدرج الكثافة إحدى أكثر الخطوات أهمية في هذه التجربة، وذلك لضمان الحصول على خلايا pbmc معزولة بدرجة نقاء عالية وبأدنى مستوى من التلوث بكريات الدم الحمراء.
الآن، افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي. يجب أن تظهر ثلاث طبقات متمايزة: طبقة البلازما العلوية، وطبقة تدرج الكثافة في قاع الأنبوب، وطبقة رقيقة من خلايا PBMC في المنتصف.
باستخدام ماصة PE، قم بإزالة الطبقة العلوية مع الحرص على عدم سحب طبقة الطور البيني. بعد ذلك، استخدم ماصة سعة 10 milliliter لنقل pbmc بعناية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. اخلط الخلايا مع 20 milliliters من PBS ثم قم بطردها مركزياً لإزالة أي آثار من تدرج الكثافة.
بعد ذلك، اغسل الراسب في 20 ملليلتر أخرى من PBS لإزالة الصفائح الدموية. أعد تعليق الراسب الثاني في وسط كريات الدم البيضاء الكامل بتركيز 1 × 10⁷ خلية لكل ملليلتر. لإعداد المزرعة المشتركة من الخلايا الجذعية الميزنشيمية وكريات الدم البيضاء، قم بتدفئة وسط الخلايا الجذعية الميزنشيمية الكامل مسبقاً إلى 37 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة.
بعد ذلك، قم بستزراع 5 × 10⁴ من الخلايا الجذعية الميزنشيمية (MSC) لكل 1 مل من وسط MSC الكامل في كل بئر من أطباق ذات 24 بئرًا، واتركها لتلتصق طوال الليل عند 37 درجة مئوية، حتى تصل الخلايا إلى درجة تلاحم بنسبة 80%. وفي الصباح التالي، قم بشفط الوسط وأضف العدد المناسب من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) الموصومة بـ CFSE إلى الخلايا الجذعية الميزنشيمية (MSC) في 1 مل من وسط الكريات البيضاء الكامل. وبنسبة 1 إلى 10 من MSC إلى PBMC، قم بتنشيط الخلايا باستخدام 10 ميكروغرام من PHA لكل مل من وسط الكريات البيضاء الكامل.
بعد ذلك، وفي اليومين الثالث والخامس من الزراعة المشتركة، يتم نقل العدد المناسب من الزراعة المشتركة إلى أنابيب فاكس ذات قاع مستدير، وتقييم تكاثر الكريات البيضاء المسمى بـ CFSE عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي لإجراء مقايسة تثبيط الخلايا المؤثرة. ابدأ بإعداد زراعة مشتركة من M-S-C-P-B-M-C كما تم توضيحه للتو، باستخدام 2.5 × 10⁶ من p BMCs مزروعة بشكل مشترك مع 250,000 من MSCs، وذلك لضمان وجود عدد كافٍ من p BMCs في الزراعة المشتركة مع MSC لغرض اختيار المجموعة الفرعية.
بعد مرور 48 إلى 72 ساعة عند 37 درجة مئوية، اختر كريات الدم البيضاء ذات القدرة التعديلية المناعية والمحفزة بواسطة MSC المطلوبة باستخدام الخرزات المغناطيسية المناسبة. بعد ذلك، أضف خلايا T الموجبة لـ CD4 الخيفية والموسومة بـ CFSE في 1 مل من وسط كريات الدم البيضاء الكامل لكل بئر بنسب تجريبية مختلفة. بعد ذلك، أضف الخرزات الدقيقة المقترنة بـ anti CD 3 28 بنسبة 1:1 (خرزة إلى خلية) لتحفيز خلايا T الموجبة لـ CD4.
في اليوم الثالث من الزراعة المشتركة، يتم تقييم تكاثر الخلايا التائية الموجبة لـ CD4 والموسومة بـ CFSE عن طريق قياس التدفق الخلوي. تُعد الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) خلايا ملتصقة ذات مورفولوجيا مغزلية ليفية، بينما تكون الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) وكريات الدم البيضاء خلايا صغيرة مستديرة غير ملتصقة، مما يسمح بالتمييز الواضح بين هاتين المجموعتين من الخلايا. في الزراعة المشتركة، وعندما لا يكون هناك تكاثر، تظهر الخلايا الموسومة بـ CFSE كقمة واحدة ذات إيجابية عالية ووميض حاد عند تنشيط الخلايا.
يظهر التكاثر على هيئة عدة قمم أصغر مع فقدان وإزاحة جهة اليسار في شدة الفلورة عند حدوث تثبيط للتكاثر. فعلى سبيل المثال، في المزارع المشتركة للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC)، يتناقص عدد القمم الصغيرة المتعددة مع زيادة مصاحبة في شدة الفلورة، وهو ما يتضح من إزاحة القمم إلى اليمين وزيادة حدة القمة الموجودة في أقصى اليمين، والتي تمثل الخلايا غير المنقسمة في مقايسة تثبيط الخلايا المؤثرة. ويمكن تقييم التأثير التثبيطي للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) على تكاثر الخلايا التائية الموجبة لـ CD4 بشكل أكبر بطريقة تعتمد على الجرعة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم التعديل المناعي للخلايا الجذعية الميزنكيمية البشرية. لا تنسَ أن العمل مع الخلايا البشرية قد يكون خطيراً وأنه يجب اتخاذ الاحتياطات دائماً.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تستقصي هذه الدراسة الخصائص المعدلة للمناعة للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) البشرية باستخدام نظام زراعة مشتركة مع كرات الدم البيضاء في الدم المحيطي. ويركز التقييم على تكاثر كرات الدم البيضاء المؤثرة ومجموعات فرعية محددة، مما يسلط الضوء على الأهمية العلاجية المحتملة للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs).
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم المناعة
- أبحاث الخلايا الجذعية
- تكاثر الخلايا
خلفية علمية
- تمتلك الخلايا الجذعية الميزنكيمية البشرية (MSCs) خصائص معدلة للمناعة.
- يعد فهم تفاعلات الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) مع كريات الدم البيضاء أمراً بالغ الأهمية للتطبيقات العلاجية.
- يمثل تكاثر كريات الدم البيضاء المؤثرة جانباً رئيسياً من الاستجابة المناعية.
- يمكن لأنظمة الزراعة المشتركة أن تعمل كنموذج فعال لهذه التفاعلات في المختبر (in vitro).
الغرض من الدراسة
- تقييم التأثيرات المعدلة للمناعة للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) على تكاثر الكريات البيضاء.
- توضيح آليات التعديل المناعي للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs).
- استكشاف الأهمية العلاجية للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) في التطبيقات السريرية.
الطرق المستخدمة
- نظام الزراعة المشتركة للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) وكريات الدم البيضاء في الدم المحيطي.
- استخدام إستر سكسينيميديل كاربوكسيفلوريسين (CFSE) لتتبع الخلايا.
- تقييم تكاثر كريات الدم البيضاء المؤثرة.
- تحليل مجموعات فرعية محددة من كريات الدم البيضاء.
النتائج الرئيسية
- إثبات قدرة الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) على تعديل تكاثر الكريات البيضاء.
- تحديد المجموعات الفرعية المحددة التي تأثرت بالخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs).
- تقديم رؤى حول آليات التعديل المناعي للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs).
- تسليط الضوء على الإمكانات العلاجية للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) في السياقات الطبية.
الاستنتاجات
- تُظهر الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) تأثيرات تعديلية مناعية ملحوظة على كرات الدم البيضاء.
- تدعم النتائج الاستخدام العلاجي للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) في السياقات السريرية.
- هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث للفهم الكامل للآليات المعنية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يوفر تقييم الوظيفة التعديلية المناعية للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) عبر مقايسات تكاثر الكريات البيضاء القائمة على CFSE طريقة كمية وقابلة للتكرار لتقييم الإمكانات العلاجية في الأمراض المناعية. ويدعم هذا النهج التحقق من الهدف من خلال تمكين تقليل المخاطر الميكانيكية للكبح المناعي بوساطة MSC قبل الاستثمار في الدراسات قبل السريرية. كما أن قابلية هذا المقايسة للتكيف مع مجموعات فرعية محددة من الكريات البيضاء تعزز الثقة التنبؤية في اختيار المرشحين الرائدين لمسارات التعديل المناعي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء تثبيط تكاثر الكريات البيضاء المؤثرة بوساطة الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) كقراءة وظيفية للنشاط المعدل للمناعة.
- القيمة التشغيلية: يوفر طريقة معيارية تعتمد على الوسم لقياس تاريخ الانقسام وحركية التكاثر دون استخدام المواد المشعة.
- القيمة العلمية: يدعم الفحص المظهري للمتبرعين بالخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) أو استراتيجيات التهيئة المسبقة من خلال قياس تثبيط تكاثر الكريات البيضاء الموُسمة بـ CFSE.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تسمح بعزل وتتبع مجموعات فرعية محددة من الكريات البيضاء (مثل خلايا T ذات الواسم CD4+) عبر الاختيار باستخدام الخرزات المغناطيسية قبل الزراعة المشتركة، مما يتيح تحديد ملامح التعديل المناعي الخاصة بكل مجموعة فرعية.
- القيمة التشغيلية: توفر ملامح تخفيف CFSE الناتجة عن قياس التدفق الخلوي بيانات كمية ومتعددة المعايير حول تثبيط التكاثر وتاريخ الانقسام.
- القيمة العلمية: تسهل تقييم الاستجابة للجرعة من التعديل المناعي للخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) عبر نسب متفاوتة من الخلايا الجذعية الوسيطة إلى الكريات البيضاء وظروف تنشيط مختلفة (مثل التحفيز بواسطة PHA).
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يربط بين القدرة على التعديل المناعي في المختبر والفعالية السريرية المحتملة في الأمراض المرتبطة بالمناعة من خلال نمذجة التفاعل المتبادل بين الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) والخلايا البيضاء.
- القيمة التشغيلية: يتيح أخذ عينات طولية (على سبيل المثال، في اليومين 3 و5) لتقييم الديناميكيات الزمنية للتثبيط والتعافي.
- القيمة العلمية: يدعم التقييم المتوافق مع المؤشرات الحيوية من خلال ربط تثبيط التكاثر بالتعبير عن السيتوكينات داخل الخلايا في الخلايا البيضاء المستزرعة معاً.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يُدمج مقايسة تكاثر الكريات البيضاء القائمة على CFSE ضمن سير عمل الاكتشاف المبكر كأداة فحص وظيفية لتعديل المناعة، مما يربط بين مراحل التحقق من الهدف وتحسين المركبات الرائدة للعلاجات القائمة على MSC.
- بيولوجيا الاكتشاف: يختبر الفرضية القائلة بأن الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) تثبط تكاثر الكريات البيضاء، مما يوفر رؤية ميكانيكية للمسارات المثبطة للمناعة.
- الفحص: يقدم قراءات كمية قابلة للتكرار للتكاثر تتيح المقارنة بين دفعات الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC)، أو المتبرعين، أو ظروف التحفيز الأولي.
- التحليلات: يولد بيانات قياس التدفق الخلوي القادرة على تحليل ذروات التكاثر، وتتبع الانقسامات، والاستجابات الخاصة بمجموعات فرعية في مجموعات الكريات البيضاء غير المتجانسة.
- الأبحاث الانتقالية: ينمذج التفاعلات بين الخلايا المناعية البشرية والخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) في المختبر، مما يدعم الاستقراء إلى سياقات التعديل المناعي السريرية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس منصة نمطية قابلة للتكيف يمكن تطبيقها عبر أنواع الخلايا المناعية وظروف التحفيز ذات الصلة بالأمراض.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: يقلل من الغموض الميكانيكي من خلال تقديم دليل مباشر وقابل للقياس على تثبيط الكريات البيضاء بوساطة الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs).
- القيمة التشغيلية: يضمن توحيد المقايسة من خلال تحديد نسب الخلايا الجذعية الميزنكيمية إلى الكريات البيضاء، وبروتوكولات وسم CFSE، واستراتيجيات تحديد البوابات في قياس التدفق الخلوي.
- القيمة الاستراتيجية: يحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تحديد الخلايا الجذعية الميزنكيمية ذات النشاط التعديلي المناعي القوي والقابل للتكرار في مرحلة مبكرة من التطوير.
- التأثير على المحفظة: يتيح تحديد الأولويات للمرشحين من الخلايا الجذعية الميزنكيمية بناءً على تعديل المخاطر، وذلك بالاعتماد على القوة الوظيفية للتعديل المناعي بدلاً من الاعتماد على المؤشرات المظهرية وحدها.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في عزل الكريات البيضاء الأولية، ووسم CFSE، وتحليل قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان.
- يعتمد على توفر أجهزة قياس التدفق الخلوي القادرة على تحليل قمم تخفيف CFSE وأنظمة الفصل بالخرز المغناطيسي لعزل المجموعات الفرعية.
- يستلزم توحيد ظروف تنشيط الكريات البيضاء (على سبيل المثال، تركيز PHA) وبروتوكولات الزرع المسبق للخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSC) عبر جميع المواقع.
- يتطلب تحسين نسب MSC:leukocyte ومدة الزراعة المشتركة لتجنب آثار فرط النمو أو استنفاد المغذيات.
- يتقيد بتباين المانحين في استجابة الكريات البيضاء، مما يستلزم استخدام ضوابط من مانحين مجمعين أو متطابقين للحصول على مقاييس تثبيط قابلة للتكرار.
