الكشف عن التعبير الجيني بين الخلايا في الخلايا الحية من الفئران، الإنسان ولحم الخنزير المنشأ عن طريق النانوية المسمى الإسفار

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل التعبير الجيني داخل الخلايا مباشرة في الخلايا الحية من خلال تطبيق جسيمات نانوية فلورية متخصصة لجينات معينة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحديد التسلسلات المستهدفة المناسبة في الجين محل الاهتمام. أما الخطوة الثانية فهي تصنيع جسيمات نانوية تحتوي على خيوط التقاط وإبلاغ محددة.

بعد ذلك، تُضاف الجسيمات النانوية مباشرة إلى وسط استزراع الخلايا الحية. وتتمثل الخطوة النهائية في تحضين الخلايا مع الجسيمات النانوية طوال الليل عند 37 درجة مئوية و5%CO2 في جو مرطب. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الفلوري لتصور الفلورة النوعية للجينات في الخلايا المستهدفة الحية، بينما يُستخدم تحليل قياس التدفق الخلوي لتقدير عدد الخلايا الفلورية كمياً.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الكيمياء النسيجية المناعية، أو المنارات الجزيئية، أو تحليل PCR، في إمكانية مراقبة التعبير الجيني بصرياً في الخلايا الحية دون الحاجة إلى أي معالجة للمزرعة الخلوية. ستقوم مارتينا تيريزا، وهي عالمة أحياء وطالبة دكتوراه في مختبرنا، باستعراض الإجراء، بينما ستقوم لينيت هنكل بتنفيذ قياس التدفق الخلوي. بعد تحديد التسلسلات المستهدفة، يتم طلب جسيمات الذهب النانوية المجففة بالتجميد من المصادر التجارية المتاحة.

تتكون هذه الجسيمات من جسيم ذهبي مركزي مرتبط تساهمياً بشريط التقاط، والذي يكون بدوره مرتبطاً بشريط مراسل. وعندما يرتبط mRNA المستهدف بشريط الالتقاط، يتم تحرير الشريط المراسل والفلوروفور المرتبط به في المحلول، مما يسمح لـ Fluor four بإصدار وميض فلوري. قبل عملية إعادة التكوين.

يجب تخزين الجسيمات النانوية عند درجة حرارة 4 °C في الظلام داخل صندوق من الورق المقوى. ولإعادة تشكيل جسيمات الذهب النانوية، أضف 20 µL من الماء المقطر مرتين، مما ينتج عنه تركيز نهائي قدره 100 nM. ويمكن تخزين الجسيمات النانوية المعاد تشكيلها في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة سنة واحدة على الأقل.

في يوم التطبيق، يتم تخفيف المحلول المخزون من جسيمات الذهب النانوية لتحضير محلول عمل بتركيز 20 x في محلول PBS. يتم إخراج طبق ذي 24 بئراً يحتوي على خلايا HEK 2 93 من حاضنة زراعة الخلايا، ثم يُسحب الوسط ويُضاف 237.5 µL من وسط زراعة جديد، بعد ذلك يتم نقل 12.5 µL من محلول العمل للجسيمات النانوية بواسطة الماصة إلى كل بئر مُجهز، ويُرج الطبق لضمان التوزيع المتساوي للجسيمات النانوية. تُحضن الخلايا طوال الليل عند 37 °C و 5% CO2 في جو رطب. في اليوم التالي.

قم بتحليل المزارع الخلوية للكشف عن الفلورة الخاصة بالموقع الجيني الثالث باستخدام مجهر فلوري قياسي لتجهيز الخلايا لقياس التدفق الخلوي. اغسل خلايا HEK 2 9 3 التي تظهر فلورة مستحثة في الموقع الثالث مرة واحدة باستخدام PBS، ثم أضف 1 ml من 0.05%trypsin EDTA، وحضن الخلايا لمدة 3 دقائق عند 37 °C و 5%CO2. بعد فترة التحضين، أضف 0.5 ml من وسط CO وقم بالماصة صعوداً وهبوطاً.

بعد ذلك، يتم نقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 milliliter. أضف ثلاثة milliliters من وسط الزرع، ثم قم بطرد الأنبوب مركزياً لمدة خمس دقائق عند 300 ×g. بعد ذلك، تخلص من الرائق وأعد تعليق الخلايا في 200 µL من منظم الفاكس (fax buffer) المبرد على الثلج. انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 1.5 milliliter واحفظها على الثلج في الظلام حتى وقت التحليل.

قبل تحليل التدفق الخلوي، قم بتمرير الخلايا عبر مرشح بمقاس 30 µm لمنع تكتل الخلايا. بعد ذلك، أضف يوديد البروبيديوم إلى الخلايا بتركيز نهائي قدره 2 µg/mL لمدة دقيقتين على الأقل، ثم انقل الخلايا إلى جهاز قياس التدفق الخلوي واستخدم جهاز المزيج الدوامي (vortex) ثم قم بتحميل أنبوب العينة في الجهاز. وذلك للكشف عن الخلايا الموجبة لـ SI three.

استخدم خلايا تحكم غير معالجة لضبط البوابات الهرمية على مجموعة مساحة التشتت الأمامي (FSC area) مقابل مساحة التشتت الجانبي (SSC area)، وارتفاع FSC مقابل FSC مع المجموعة الفرعية، وارتفاع SSC مقابل SSC مع المجموعة الفرعية لاستبعاد حطام الخلايا والخلايا غير المشتتة. استبعد الخلايا الميتة من التحليل بناءً على صبغة يوديد البروبيديوم عن طريق عرض قناة PE مقابل قناة PE Texas Red، ثم قم بإجراء بوابة الفرز النهائية على الخلايا الإيجابية لـ PE في الموقع الثالث. الكشف عن GA dh.

تم إجراء فحص لجين تدبير منزلي يتم التعبير عنه بشكل مستمر في خلايا HEK 2 93 للتحقق من الجدوى التجريبية. تُظهر الجسيمات النانوية الضابطة السلبية العشوائية وميضاً ضئيلاً أو معدوماً، بينما يظهر امتصاص إيجابي وميضاً دائماً. وتُظهر العينات الضابطة إشارة قوية بعد الحضانة طوال الليل.

ثبت أن هذه الجسيمات النانوية تكتشف تحديداً واسمات الخلايا الجذعية متعددة القدرات، وهي التعبير الجيني لـ nano و GDF three في الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية والخنزيرية أو IPCs. ومن المهم ملاحظة أن هذه الواسمات تم اكتشافها فقط في IPCs وليس في الخلايا الليفية التي استُخدمت كطبقة مغذية أثناء زراعة خلايا IPS. وقد استُخدم التحليل البصري والكمي عبر قياس التدفق الخلوي لتقييم كفاءة وسم جسيمات GA DH النانوية بتدرج في تركيز الجسيمات النانوية من 0 إلى 1000.

أُجري اختبار PICO molar باستخدام خلايا HEK 2 93، والتي أظهرت زيادة واضحة في التألق تعتمد على التركيز. بعد ذلك، أُجري تحليل كمي في خلايا جذعية جنينية للفئران، والتي أظهرت وجود حوالي 40% من الخلايا الموجبة لـ CY three بعد إضافة 400 من جسيمات GA DH النانوية بتركيز PICOMOLAR. كما تم الحصول على قيم مماثلة بالنسبة لعلامات تعدد القدرات.

بمجرد إتقان تقنيتي Nano و GDF three، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون 16 ساعة إذا طُبقت بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الجسيمات النانوية المتخصصة في الجينات للكشف عن التعبير الجيني داخل الخلايا مباشرة في الخلايا الحية باستخدام المجهر الفلوري.