الظهارية إعادة تعمير خلية وإعداد القوارض خارج الخلية مصفوفة السقالات للتنمية نسيج الكلى

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعادة ملء سقالات مصفوفة الكلى القوارض ثلاثية الأبعاد خارج الخلية مع الخلايا الظهارية الكلوية البشرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الخلايا أولا ، وهي كلية فئران هاو مع سلسلة من المحاليل المنظفات التي يتم تغليفها عبر الشريان الكلوي على مدى 26 ساعة. ثم يتم تعقيم الكلى ويتم حقن سقالات المصفوفة الكلوية خارج الخلية اللاخلوية ب 40 مليون خلية كلوية قشرية أنبوبية أو ظهارية RCTE تحت نضح شرياني مسبق مستمر داخل نظام مفاعل Biore مصمم خصيصا.

في النهاية ، يمكن تقييم قدرة خلايا RCTE على إعادة ملء سقالة الكلى عن طريق فحص ER والتروية والتحليل الكيميائي المناعي. تسمح تقنية زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد هذه للمحققين بإعادة ملء مصفوفة خارج الخلية بأكملها. تترسب خلايا السقالة داخل الفضاء المحيط بالأنبوب داخل المصفوفة خارج الخلية للسماح بالتحقيق والعوامل المرتبطة التي تؤثر على نمو الخلايا وتمايزها ونضجها.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق البديلة مثل تصنيع سقالات البوليمر الاصطناعية ، هي أن المصفوفة الكلوية خارج الخلية تسهل التصاق الخلايا المنحشرة وتكاثرها ونضجها داخل شبكة معقدة من البروتينات الهيكلية الطبيعية وعوامل النمو والمكونات البيولوجية الأخرى. ابدأ إجراء إزالة الخلايا عن طريق توصيل قسطرة الشريان الكلوي لكل كلية مذابة بنهاية أنبوب دائرة التروية في اتجاه مجرى النهر من المضخة ، مما يضمن عدم احتجاز فقاعات الهواء في القسطرة. في حالة وجود فقاعات هواء في القسطرة، استخدم ماصة صغيرة سعة 200 ميكرولتر لسحب الفقاعات وملء القسطرة بالسوائل.

قم بتعليق الكلية على طول الجدار الداخلي لكوب فارغ سعة خمسة لترات بحيث لا يلتوي الشريان الكلوي أو ملفوفا ، واضبط محرك المضخة على خمسة ملليلتر في الدقيقة. ثم اضغط على ابدأ بعد التأكد من أن كل كلية تتدفق من خلال ملاحظة تقطير المحاليل من أسفل العضو بالإضافة إلى كل كلية مع المحاليل المناسبة كما هو محدد في مخطط التدفق في نهاية التروية ، وتخزين الكلى منزوعة الخلايا في PBS في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر عند أربع درجات مئوية أو اثنتين كحد أقصى. بعد تجميع دائرة التروية ، نقوم بإزالة الغطاء اللولبي الأحمر على رأس المفاعل الحيوي والماصة 50 مل من 0.1٪ لكل حمض الأسيتيك ، 4٪ محلول الإيثانول في الخزان المتوسط من خلال الفتحة.

باستخدام خرطوشة مضخة كبيرة ، قم بتوصيل جزء أنابيب المضخة التمعجية برأس المضخة. ثم اضبط معدل التدفق إلى خمسة ملليلتر في الدقيقة. اضغط على ابدأ واترك الدائرة بالتحضير عندما يملأ السائل خط الوفرة ويصل إلى المنفذ المفتوح المتبقي لقضيب التوقف ثلاثي الاتجاهات.

استخدم قابس إغراء ذكر لتوصيل المنفذ. اسمح للدائرة بالتحضير الكامل حتى لا يلاحظ أي هواء في أنبوب دائرة التروية أو داخل المدخل. يقوم متقبل الإغراء بطرد الفقاعات من دائرة التروية عن طريق زيادة معدل تدفق المضخة مؤقتا.

عندما يكون النظام جاهزا بالكامل ، أوقف محرك المضخة وتقوم بتعقيم ملقط بستة بوصات. لتوصيل نهاية الإغراء الأنثوي لقسطرة الشريان الكلوي بعناية بمدخل الذكور ، قم بإغراء المتقبل على السطح الداخلي لرأس المفاعل الحيوي ، مع التأكد من أن الاتصال محكم وعدم ترك أي هواء في القسطرة. اسمح للكلية بالتعليق برفق من قسطرة الشريان الكلوي حتى لا يلتف الشريان الكلوي أو يلتوى.

ثم شد المشبك المعدني الذي يربط رأس المفاعل الحيوي والجسم معا بحيث يتم إغلاق خزان المفاعل الحيوي بإحكام وإغلاق غطاء المسمار. الآن تعقيم الكلى بتروية درجة حرارة الغرفة لمحلول الإيثانول حمض الأسيتيك بمعدل خمسة ملليلتر في الدقيقة. بعد ساعة واحدة ، أوقف المضخة وافتح الغطاء اللولبي الأحمر.

باستخدام آفة معقمة، تقوم الماصة بشفط كل المحلول بعناية من خزان المفاعل الحيوي. ثم ماصة 50 مل من PBS الطازج في خزان المفاعل الحيوي. أغلق الغطاء اللولبي وابدأ تشغيل المضخة لمدة ثلاث ترويات متتالية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بمعدل خمسة ملليلتر في الدقيقة.

بعد شطف PBS النهائي ، قم بشفط المحلول الملحي من الخزان وأضف 50 مل من الوسط إلى الخزان مع إغلاق غطاء لولبي. نقل المفاعل الحيوي بدائرة التروية المرفقة إلى حاضنة ذات سعة كبيرة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثم قم بتوصيل دائرة نضح المفاعل الحيوي بالمضخة وقم ببث الكلى بمعدل أربعة ملليلتر في الدقيقة لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل البذر.

للسيلولاري ، تجمع الكلى عددا كافيا من قوارير الثقافة لتركيز الجلوس المطلوب. بعد ذلك ، بعد شفط وسط الثقافة من كل قارورة ، استخدم 10 ملليلتر من إنزيم فصل الخلية المناسب لرفع الخلايا الظهارية الأنبوبية القشرية الكلوية من القارورة عند 37 درجة مئوية. بعد 10 دقائق ، ابدأ في فحص القوارير على مجهر تباين الوجه كل دقيقتين حتى يتم ملاحظة انفصال الطية.

ثم بعد أخذ كمية صغيرة من الخلايا للعد ، قم بتخفيف تعليق الخلية المصاحبة بحجم متساو من الوسط المسبق وقم بالطرد المركزي للخلايا العصيية. قم بتعليق الحبيبات بحجم مناسب من وسط الثقافة للحصول على تركيز نهائي مرتين في 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر. انقل ملليلترين من تعليق الجلوس ، طبق ثقافة 35 ملم ، ثم ارسم حجم المليلتر في حقنة معقمة سعة خمسة ملليلتر.

انقل المفاعل الحيوي للتروية إلى خزانة السلامة البيولوجية وأدر صمام القرص الحابس لإغلاق التدفق إلى منفذ الجلوس. قم بإزالة زلة إغراء الذكور ، وقم بتوصيلها من قضيب الإيقاف وقم بتوصيل المحقنة. ثم انقل دائرة التروية بسرعة إلى الحاضنة واستخدم خرطوشة المضخة الكبيرة لتأمين جزء أنبوب المضخة التمعجية برأس المضخة لتثبيت الخلايا.

أغلق منفذ صمام الديك الحابس الذي يشير إلى المضخة وحقن الخلايا ببطء في سقالة الكلى. ثم أدر صمام محبس التثبيت لإغلاق التدفق من المحقنة وابدأ تشغيل المضخة بسرعة 25 مل في الدقيقة. بعد 15 دقيقة ، قم بخفض معدل تدفق المضخة إلى أربعة ملليلتر في الدقيقة ، واستبدل الوسيط في اليوم التالي وكل يومين بعد ذلك.

لتقييم صلاحية وتكاثر الخلايا ، قم بتبادل وسط المزرعة بشكل معقم مع 10 ملليلتر من محلول عمل الزارين لمدة أربعة ملليلتر في الدقيقة من سقالات الكلى بعد ساعة واحدة بالضبط ، اجمع محلول الزارين المكيف والمخفض جزئيا وقم بإجراء تروية أخرى بمقدار أربعة ملليلتر في الدقيقة. مع 100 مل من الثقافة الطازجة ، أصبحت الكلى المتوسطة المليئة بالتتابع بالماء ومحاليل المنظفات المخففة أكثر شفافية بشكل تدريجي على مدار 26 ساعة عن طريق نضح المنظفات النهائي ، وشبكة الأوعية الدموية للكلى ، وعلى وجه الخصوص ، يتم عرض الأوعية بين الفصوصات بشكل بارز في السقالة منزوعة الخلايا. يتم تطهير العضو بأكمله من الخلايا الأصلية تاركا وراءه شبكة الغشاء القاعدي السليمة من أنابيب الكبيبات وتجميع القنوات والمصفوفة خارج الخلية للأوعية الدموية منزوعة الخلايا.

بالإضافة إلى الأوعية الكبيرة ، تحتفظ الأغشية القاعدية للأوعية الدموية الدقيقة داخل الكبيبات بسلامتها الهيكلية أيضا. خلايا RCTE المزروعة في سقالة الكلى كما أظهرت للتو أنها موطن في المقام الأول للمناطق القشرية لسقالة الكلى حيث تعيد بشكل تفضيلي ملء الأنابيب الكبيبية البيريجية. عدد قليل من الخلايا المضمنة داخل الكبيبات في اليوم الأول بعد البذر ، وبحلول اليوم السابع ، تكون الكبيبات خالية فعليا من الخلايا بينما تشغل غالبية هذه الخلايا المناطق القشرية من المصفوفة الكلوية خارج الخلية.

بعد سبعة أيام من ثقافة التروية القبلية ، توجد العديد من أنابيب خط RCTE في الأنابيب النخاعية والحليمية الخارجية وتجمع البط بعد إعادة توطين خلايا RCTE وأسبوع واحد من ثقافة التروية. ومع ذلك ، فإن الشفافية التي لوحظت بعد إزالة الخلايا تفقد وتبدو الكلية المعتمة وأقرب في المظهر إلى حالتها الأصلية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل أو التحليل الكيميائي المناعي لوسائط الثقافة المشروطة للإجابة على أسئلة إضافية مثل ، كيف تتغير الحالات الأيضية أو المظهرية لهذه الخلايا داخل المصفوفة الكلوية خارج الخلية؟

القدرة على تطوير سقالات خارج الخلية وإضافة مبيعات المانحين إلى المصفوفة للباحثين بتحديد النمو والنضج في ثلاثة أبعاد داخل سقالات مصفوفة الكلى الخارجية الطبيعية. الهدف النهائي هو استخدام هذه التقنية كأداة لفهم آليات إصلاح الكلى وتجديدها بشكل أفضل.