جيل المعدلة وراثيا الثقافات الجلد الميتة عضوي عن طريق الأدمة الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد مزارع جلدية معدلة وراثيا باستخدام الأدمة البشرية المتنشطة لتحديد تأثير التعبير الجيني المتغير على نمو البشرة وتمايزها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأمراض الجلدية ، مثل تحديد الجينات المسؤولة عن نمو epi والتمايز والتقدم إلى المرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن جلد الإنسان المعدل وراثيا يتم إنشاؤه في غضون أيام قليلة ، مما يسمح بدراسة العينات البشرية التي يحتمل أن تكون ذات صلة سريريا.

عرض الإجراء سيكون مازحا من مختبري. في حالة تلقي جلد بشري متجمد ، ضع الأنسجة في غطاء مزرعة الأنسجة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق حتى يذوب. بمجرد إذابته ، انقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مليلتر أو زجاجة سعة 125 مليلتر ، حسب الحجم.

بعد ذلك ، أضف أربعة × البنسلين والستربتومايسين في XPBS واحد حتى تمتلئ الحاوية بنسبة 75٪. قم بتغطية الحاوية ورجها بقوة لمدة خمس دقائق. قم بإزالة محلول المضادات الحيوية وكرر ذلك.

خطوة ثلاث مرات أخرى بعد الغسيل الأخير ، انقل الأنسجة إلى وعاء جديد وأضف محلول مضاد حيوي جديد. احتضان هذا الخليط في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة أسبوعين للسماح بفصل الأدمة عن البشرة. بعد مرور أسبوعين ، استخدم الملقط لتقشير البشرة من الأدمة.

تخلص من البشرة وفقا لبروتوكول المؤسسة للتعامل مع الأنسجة البشرية. ضع الأدمة في وعاء من محلول المضادات الحيوية واغسلها بهز قوي كما كان من قبل. بعد الغسيل الأخير ، انقل الأدمة إلى وعاء جديد من محلول المضادات الحيوية وقم بتخزينها على درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام في اليوم السابق لخلايا فينيق بذور التعداء في وسائط كاملة في صفيحة من ستة آبار بكثافة 800،000 خلية لكل بئر.

في يوم التعدي ، امزج ستة ميكرولترات من كاشف التعداء مع 100 ميكرولتر من dmm. لكي يتم نقل كل بئر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، أضف الخليط إلى أنبوب يحتوي على ثلاثة ميكروغرامات من ناقل الفيروسات القهقرية لكل بئر ليتم نقله واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، أضف هذا الخليط بأكمله بالتنقيط إلى كل بئر من خلايا العنقاء واحتضان الخلايا طوال الليل في اليوم التالي للتعداد. قم بإزالة الوسائط من خلايا العنقاء وأضف ملليلترين من الوسائط الكاملة الطازجة في نفس اليوم.

أعد تعليق الخلايا الكيراتينية البشرية الأولية في وسط خال من مصل الخلايا الكيراتينية مع المضادات الحيوية والبذور في ستة ألواح حائط بكثافة 75،000 خلية لكل بئر. في اليوم التالي ، حصاد الوسائط التي تحتوي الآن على جزيئات فيروسية من خلايا فينيكس المنقولة. مرر الوسائط عبر مرشح 0.45 ميكرون باستخدام حقنة لإزالة أي خلايا ملوثة.

أضف خمسة ميكروغرام لكل مليلتر من سداسي ثنائي ميثيل بروميد إلى الوسائط المحتوية على الفيروس المصفى للمساعدة في التوسط في عملية العدوى. ثم ماصة ملليلترين من الفيروس على الخلايا الكيراتينية المطلية في اليوم السابق. بعد ذلك ، قم بتدوير ألواح الحائط الستة في جهاز طرد مركزي بسرعة 200 جي ثانية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد الدوران، قم بإزالة الوسائط التي تحتوي على فيروس وتجاهلها. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام XPBS ثم أضف K-C-S-F-M الطازج في اليوم التالي. إصابة نفس الدفعة من الخلايا الكيراتينية بالفيروس باستخدام الإجراء الموضح للتو.

لصنع أشرطة عضوية. استخدم الكي لإزالة سنتيمتر واحد في سنتيمتر مربع واحد من منتصف غطاء طبق زراعة الأنسجة بطول 3.5 سم. قم بتوصيل أوتاد مربعة بالجزء السفلي من الكاسيت باستخدام طلاء أظافر شفاف واتركي خمس دقائق حتى يجف طلاء الأظافر.

أخيرا ، اقلب الكاسيت وضع الكاسيت في طبق يبلغ طوله ستة سنتيمترات مع وضع كاسيت على الأوتاد. استرجع الأدمة من تخزين أربع درجات مئوية وانقلها إلى وعاء من نمو الخلايا الكيراتينية. متوسطة للغسل.

بعد تكرار الغسيل ، ضع الأدمة في KGM طازجة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة يومين. بعد الحضانة ، استخدم مشرطا لتقطيع الأدمة إلى قطع بحجم 1.5 سم × 1.5 سم. ثم ضعه على الفتحة المربعة للنمط العضوي بحيث يكون الجزء العلوي من الأدمة متجها لأعلى.

استخدم الملقط لقلب الكاسيت العضوي بالكامل الذي يحتوي على الأدمة. أضف خمس قطرات من المصفوفة خارج الخلية الطازجة إلى الجزء السفلي من الأدمة ورجيها قليلا لضمان التوزيع المتساوي عبر الأدمة. بعد السماح للمصفوفة خارج الخلية بالتصلب لمدة خمس دقائق ، استخدم الملقط لقلب الكاسيت مرة أخرى ، ثم أضف أربعة ملليلتر من KGM إلى الطبق الذي يبلغ طوله ستة سنتيمترات.

بعد ذلك ، بعد حصاد وعد الخلايا الكيراتينية المعدلة وراثيا ، يعلق Resus 0.5 إلى 1 مليون خلية في 90 ميكرولتر من KGM ويوزع الخلايا على الأدمة. احتضان الثقافة المشتركة عند 37 درجة مئوية. قم بتغيير وسائل الإعلام على الثقافات كل يومين.

ما يحدث التقسيم الطبقي الكامل والتمايز للبشرة بعد اليوم الخامس. يمكن حصاد الأنسجة لمدة تصل إلى 14 يوما بعد الطلاء. تظهر هذه الصورة تلطيخ الهيماتين واليوزين للانشاء العضوي.

زراعة الجلد المتجددة على كل من البشرة والأدمة. البشرة طبقية بالكامل ومتمايزة بأربع طبقات متميزة ، بما في ذلك الطبقة القاعدية غير المتمايزة والطبقات الثلاث المتمايزة بما في ذلك الطبقة ، والعمود الفقري ، والرانوم ، والكورنيوم. توضح صور التألق المناعي هذه أن الإفراط في التعبير عن SNA i two كما هو موضح على اليمين يمنع تمايز البشرة مقارنة بأنسجة التحكم الموضحة على اليسار للتلوين للتمايز.

يظهر بروتين الكيراتين واحد أو K واحد باللون الأخضر ويتم تمييز النوى باللون الأزرق. يوضح تحليل RTQ PCR R لقياس مستويات mRNA من SNAI اثنين في التحكم LAC Z و S NNA I اثنان على الأنسجة المسببة أكثر من 50 ضعفا من التعبير عن SNAI اثنين بالنسبة إلى السيطرة. أخيرا ، يوضح تحليل RTQ PCR R أن الإفراط في التعبير عن SNA I ينتج عنه فقدان التعبير عن الجينات الهيكلية الناجمة عن التمايز مثل TGM one و SPRR واحد A.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل الرقائق أو التألق المناعي أو RN أو ae أو النشاف الغربي من أجل تحديد آليات النمو فوق الجافية والتمايز. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأمراض الجلدية لاستكشاف كيفية تأثير تغيير وظيفة الجينات على توازن الجلد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد ثقافات الجلد البشري العضوية المعدلة وراثيا باستخدام الخلايا الكيراتينية وتطوير الأدمة البشرية.