مقيدة المحفظة عائق النمذجة باستخدام تقنية Photothrombotic
يونيو 2, 2016
توضح هذه المخطوطة تقنية نمذجة احتشاء المحفظة. نحن هنا تستخدم تقنية photothrombotic تعديل مع كثافة منخفضة من الضوء بعد رسم الخرائط الهدف ما قبل الجراحة. باستخدام هذه التقنية، أنشأنا المحفظة نموذج احتشاء مقيدة يعانون من إعاقة حركية مستمرة.
الهدف العام من هذه التقنية هو إنشاء نموذج احتشاء محفظة محفظة مع ضعف حركي مستمر باستخدام تقنية التخثر الضوئي. قبل إنشاء احتشاء المحفظة ، من الضروري تحديد منطقة الطرف الأمامي في الكبسولة الداخلية عن طريق إدخال فيروس مرتبط بالغدة يعبر عن GFP إلى منطقة الطرف الأمامي من القشرة الحركية. ابدأ بوضع فأر مخدر في إطار تجسيم.
ثم احلق رأس الجرذ وقم بتعقيم فروة الرأس باستخدام محلول كحول وبوفيدون واليود بنسبة 70٪. حقن 2٪ ليدوكائين هيدروكلوريد تحت فروة الرأس في منطقة شق فروة الرأس المقصود لتقليل الألم أثناء الجراحة. ضع مرهم العين لمنع جفاف العينين.
وضع ستارة معقمة فوق. بعد إجراء شق في منتصف الخط بطول سنتيمترين في فروة الرأس ، ضع الذراع التجسيمية لتحديد منطقة الطرف الأمامي للقشرة الحركية وفقا للإحداثيات التجسيمية. حفر فتحة دخول في هذا الموضع.
انقل الإبرة إلى الفتحة المحفورة وقم بخفض الإبرة بمقدار ملليمتر واحد عبر الجافية إلى القشرة الحركية. استخدم مضخة صغيرة عالية الدقة لحقن ميكرو لتر واحد من الفيروس ببطء. اترك الإبرة في مكانها لمدة 10 دقائق إضافية لمنع التدفق الخلفي إلى أعلى قناة الإبرة.
بمجرد انقضاء 10 دقائق ، اسحب الإبرة ببطء. بعد تنظيف موقع العملية بالري الملحي ، قم بتأمين الجرح بخياطة 3-0 من النايلون. ثم حرر الجرذ من الإطار التجسيمي وانقله إلى غرفة الاسترداد للمراقبة.
تطبيق مسكن للسيطرة على الألم بعد الجراحة. بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع ، قم بالتضحية بالجرذ وفقا للطرق المعتمدة وقسم الدماغ المحمي بالتبريد. بعد تلطيخ GFP ، لاحظ محاور AAV-GFP المحولة في الكبسولة الداخلية باستخدام مجهر الفلورسنت.
قارن مواقع المحاور المحولة كما هو موضح في صورة الفلورسنت مع أطلس دماغ الفئران لتحديد الإحداثيات التجسيمية للمحاور المنقولة بدقة. لتحضير الواجهة العصبية البصرية ، استخدم أولا مثقاب القطع لقطع ما يقرب من أربعة سنتيمترات من إبرة شوكية قياس 27 مع نمط بداخلها. ثم قم بتجريد 10 سم من سترة الألياف الضوئية.
أدخل القطعة غير المغلفة من الألياف الضوئية في أنبوب معدني. وقم بتثبيت الأنبوب حول الألياف. ثم استخدم كوى لتثبيت الجزء السفلي من الأنبوب المعدني مرتين.
يملأ الأنبوب المعدني الفراغ بين الألياف الضوئية ومحور الإبرة الشوكية. ضع الايبوكسي القابل للشفاء بالحرارة على الألياف الضوئية. قم بتطبيق إيبوكسي إضافي على المساحة الفارغة في المحور.
وأدخل الألياف الضوئية في الإبرة الشوكية. عالج الايبوكسي لمدة 20 دقيقة عند 100 درجة مئوية لتثبيت مستقر. بمجرد الشفاء ، قم بشق الألياف الضوئية التي تبرز من الإبرة الشوكية ثم استخدم صفائح اللف الماسية لتلميع الألياف الضوئية عند طرف الإبرة الشوكية.
أخيرا ، قم بتوصيل جزء موصل FCPC من سلك التصحيح بمقرنة نظام الليزر الأخضر. ثم استخدم مقياس الطاقة الضوئية الرقمي والطاقة لقياس شدة الضوء من طرف الألياف الضوئية لضمان انبعاث الضوء بدقة. ضع وسادة حرارية تحت جسم للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37.5 درجة مئوية ، كما اعتقد الجراحة.
ابدأ بتخدير الجرذ وإعداده للجراحة كما كان من قبل. بعد عمل شق في منتصف الخط بطول سنتيمترين ، اضبط ارتفاع مشبك الأنف حتى تتم محاذاة Bregma و Lambda على نفس المستوى. المحاذاة الصحيحة أمر بالغ الأهمية لاستهداف الكبسولة الداخلية بشكل صحيح.
ضع الذراع التجسيمي لتحديد موقع التخثر الضوئي. ثم حفر حفرة بحجم ملليمترين في هذه المرحلة. بعد ذلك ، قم بتلميع وتنظيف طرف الألياف الضوئية ل ONI ، ثم قم بإصلاحه على الإطار التجسيمي دون الانحناء.
تحقق من طرف ONI للتأكد من أنه نظيف وسليم. قم بقياس شدة الليزر من طرف الألياف الضوئية قبل إدخال الواجهة الضوئية إلى الموقع المستهدف لدماغ الفئران. اضبط شدة الليزر على 3.5 مللي واط عند طرف الألياف الضوئية.
الآن ، قم بخفض ONI في المنطقة المستهدفة من الكبسولة الداخلية باستخدام الإحداثيات الظهرية البطينية المحددة في القسم الأول من البروتوكول. بعد ذلك ، قم بحقن ملليغرامين لكل كيلوغرام من روز البنغال من خلال وريد الذيل ثم ابدأ ضبط مؤقت العد التنازلي على دقيقة واحدة. عند انقضاء الدقيقة ، قم بتشغيل الليزر الأخضر 532 نانو متر لمدة 90 ثانية لإنشاء الاحتشاط.
بعد الإشعاع ، قم بإزالة ONI برفق من الدماغ. بعد تنظيف موقع العملية ، قم بتأمين الجرح بخياطة 3-0 من النايلون. ثم قم بإزالة الجرذ من الإطار التجسيمي وانقله إلى غرفة الاسترداد.
توضح هذه الصورة مدى آفات الاحتشاء عبر شدة متفاوتة من ضوء الليزر من مللي واط إلى خمسة مللي واط بعد أسبوعين من الآفة الخثارية الضوئية. تشير الأسهم إلى آفة الاحتشاء. تعتبر شدة الضوء البصري بين ثلاثة مللي واط وأربعة مللي واط في هذا الإعداد التجريبي.
تظهر الصورتان التاليتان المظهر المجهري لاحتشاء المحفظة بعد ثلاثة أسابيع من التخثر الضوئي. في هذا القسم الإكليلي من دماغ الفئران ، تشير رؤوس الأسهم إلى مسار الإبرة التي تحتوي على الألياف الضوئية في المهاد وحتى الكبسولة الداخلية. تظهر هذه الأقسام الملطخة المتسلسلة مدى آفة الاحتشاء في الكبسولة الداخلية.
تشير الأسهم إلى آفة الاحتشاء.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا المخطوط أسلوب نمذجة النوبة القشرية باستخدام أسلوب ضوء كيميائي معدل. يسمح هذا الأسلوب بإنشاء نموذج نوبة قشرية محصورة يؤدي إلى إعاقة حركية مستمرة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء العصبية
- الإعاقة الحركية
الخلفية
- ترتبط النوبات القشرية بالعجز الحركي.
- تُستخدم التقنيات الضوئية الكيميائية لإحداث إصابات دماغية موضعية.
- فهم آليات الإعاقة الحركية أمر بالغ الأهمية لتطوير الاستراتيجيات العلاجية.
- الخريطة المستهدفة ضرورية لإنشاء نموذج دقيق.
غرض الدراسة
- تطوير نموذج موثوق للنوبة القشرية.
- التحقيق في تأثيرات النوبات القشرية على الوظيفة الحركية.
- استخدام أسلوب ضوء كيميائي معدل للتوجيه الدقيق.
الأساليب المستخدمة
- تحديد منطقة الأطراف الأمامية في الكبسولة الداخلية باستخدام فيروس ناقص المرافق يعبر عن GFP.
- تحضير الفأر عن طريق التخدير ووضع إطار ستيرياتكسي.
- تعقيم فروة الرأس وتحضير الشق.
- حقن الليدوكائين لتقليل الألم أثناء العملية.
النتائج الرئيسية
- الإنشاء الناجح لنموذج نوبة قشرية محصورة.
- إثبات إعاقة حركية مستمرة بعد النوبة.
- التحقق من صحة الأسلوب الضوئي الكيميائي المعدل.
- تأسيس طريقة قابلة للتكرار للدراسات المستقبلية.
الاستنتاجات
- الأسلوب الضوئي الكيميائي المعدل فعال في نمذجة النوبات القشرية.
- يمكن استخدام هذا النموذج لدراسة الإعاقات الحركية والتدخلات المحتملة.
- يلزم إجراء مزيد من البحث لاستكشاف الآليات الكامنة للإعاقات الحركية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This photothrombotic technique enables precise modeling of white matter stroke by selectively targeting the internal capsule while sparing adjacent gray matter. The resulting circumscribed capsular infarct produces persistent motor deficits, providing a disease-relevant system for mechanistic de-risking of neurotherapeutic candidates. The model supports target validation and preclinical assessment of interventions aimed at white matter pathology, addressing a critical gap in stroke research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to white matter stroke pathophysiology.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for functional target validation in motor circuitry.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking infarct location to persistent motor impairment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable lesion volumes via optical intensity titration for dose-response assessment.
- Operational Value: Delivers highly replicable infarct models with consistent motor deficit readouts.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening in neuroprotection or neurorepair.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models white matter stroke at behavioral, circuit, and cellular levels for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on lesion specificity and functional outcome correlation.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of infarct extent with motor deficit severity for predictive biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through preclinical efficacy testing, enabling iterative refinement of neurotherapeutic strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of white matter vulnerability and circuit-specific motor pathway disruption.
- Screening: Enables assay standardization through precise lesion control and quantitative motor deficit scoring.
- Analytics: Provides volumetric infarct measurements and behavioral readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via persistent motor deficit phenotyping.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of neuroprotective and rehabilitative compounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through selective white matter infarct modeling.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via laser intensity calibration and stereotaxic targeting.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling early mechanistic de-risking of white matter pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on ability to mitigate persistent motor deficits in a validated model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector delivery, stereotaxic surgery, and optical neural interface fabrication.
- Depends on precision instrumentation including stereotaxic frames, microinjectors, and calibrated laser systems.
- Necessitates cross-team standardization for viral titer consistency, optical fiber preparation, and postoperative monitoring.
- Adaptation considerations include species-specific stereotaxic coordinates and optical properties of gray versus white matter.
- Practical limitations include surgical complexity and the need for postoperative validation via histology and behavior.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Identification of the Forelimb Area in the Internal Capsule Using AAV-GFP
3:09
Construction of the Optical Neural Interface
4:41
Photothrombotic Infarct of the Internal Capsule
6:44
Results: Microscopic Appearance of Capsular Infarct after Photothrombosis
7:38
Conclusion
