نموذج الخلايا البطانية مستو التصوير المناعية سنبس حيوية

الهدف العام لهذه التقنية هو استخدام الخلايا البطانية كنوع جديد من نموذج الخلية المقدم للمستضد المستوي للتحقيق في عمليات الإشارات المستضدية الأساسية. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في معالجة الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة التكيفية ، مثل كيفية تنسيق ديناميكيات إعادة التشكيل تحت الخلوية والجزيئية مكانيا وزمانيا داخل المشبك المناعي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن البطانة تتشكل من سطح جهاز كمبيوتر مستو تقريبا.

يسمح ذلك بالتصوير بدقة زمانية مكانية مثالية في سياق سطح خلية معقد فسيولوجيا وقابل للتشكيل. على الرغم من أن هذه الطريقة تركز على تنشيط خلايا الذاكرة المستجيب المثبت للقرص المضغوط الرابع ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقها لدراسة مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا التائية المستضد وعمليات الإشارات. اليوم ، سأوضح لك أنا وكريس إجراء البداية الثانية عن طريق كود نقل الخلايا البطانية الجلدية للرئة البشرية الأولية أو الخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة الجلدية مع غشاء YFP والأحمر DS القابل للذوبان عبر المودة النووية NU ولوحة الخلايا المنقولة على لوحات ثقافة تصوير الخلايا الحية.

في اليوم التالي ، استبدل وسط زراعة الخلية بوسط جديد مكمل بإنترفيرون جاما للحث على تعبير M MHC على الخلايا البطانية ، متبوعا بتحفيز الخلايا ب 20 نانوغرام لكل مليلتر من عامل نخر الورم ألفا بعد 24 ساعة من اليوم الثالث من 30 إلى 60 دقيقة. قبل البدء في التجربة ، احتضان البطانة بميكروغرام واحد لكل مليلتر ، كل من المستضدات الفائقة البكتيرية السموم المعوية بالمكورات العنقودية B وسم متلازمة الصدمة السمية واحد عند 37 درجة مئوية. أثناء الحضانة ، احسب عدد الخلايا القابلة للحياة من ثقافة الخلايا الليمفاوية ذات الأهمية وانقلها مرتين 10 إلى سادس الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا وأعد تعليق الحبيبات في ملليلترين من المخزن المؤقت A المحضر حديثا بحيث لا تبقى مجموعات خلايا. ثم أضف اثنين من RA الميكرومولار اثنين إلى عينة الخلية التائية ، وقم بتغطية الأنبوب واقلبه على الفور إلى متجانس. توزيع الصبغة في جميع أنحاء تعليق الخلية.

بعد حضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، قم بتدوير الخلايا الليمفاوية المصنفة وأعد تعليق الخلايا برفق ولكن تماما في 20 إلى 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت الجديد A للصورة الحية ، تقوم الخلايا بتشغيل نظام المجهر وفتح برنامج التقاط الصور المناسب. قم بتعيين المعلمات المناسبة للتصوير الآلي متعدد القنوات بفاصل زمني، بالإضافة إلى الفاصل الزمني للاقتناء من 10 إلى 30 ثانية ومدة إجمالية تتراوح من 20 إلى 60 دقيقة تقريبا. بعد ذلك ، أضف الزيت الطازج إلى الهدف.

قم بتركيب طبق مجهر يحتوي على 0.5 مل من المخزن المؤقت A على محول مرحلة التسخين ، وقم بتشغيل المحول الذي تم ضبطه مسبقا على 37 درجة مئوية على الفور. بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق من التوازن، استخدم ماصة سعة 20 ميكرولتر لإضافة الخلايا الليمفاوية المحملة ب RA المريح إلى حجرة طبق المجهر المركبة وتشغيل التصوير الساطع للمجال الساطع. حدد مسار الضوء إلى قطع العين واستخدم مقبض تركيز الدورة التدريبية لملامسة الهدف لقاع طبق المجهر.

ثم استخدم العدسة ومقبض التركيز الدقيق لتحديد موقع الخلايا التائية المستقرة في الجزء السفلي من الطبق واستخدم عناصر التحكم في مرحلة XY لتحديد حقل يحتوي على 10 خلايا على الأقل عند تحديد موقع الخلايا المناسبة. قم بالتبديل من المجال الساطع إلى مصدر ضوء الفلورسنت ومن تصوير IP إلى كاميرا CCD. تحسين معلمات الاستحواذ ثم الحصول على صور Fira 2 3 40 و FIRA 2 3 80.

تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية لتحقيق نتائج ناجحة في التحسين الدقيق لمعلمات اكتساب التألق ، مما يضمن جمع إشارة كافية وفي حالة fira two ، أن تكون نسبة خط الأساس 3 43 80 قريبة من واحد. عندما يتم تعيين مرتين للتعرض FIRA ، استبدل طبق الخلايا التائية بطبق مجهر من الخلايا البطانية باستخدام ماصة نقل يمكن التخلص منها ، وقم بإزالة الوسائط بسرعة وشطف الخلايا مرة واحدة بمليلتر واحد من المخزن المؤقت الدافئ A ، ثم استبدل الغسيل ب 0.5 مل من المخزن المؤقت الطازج A. باستخدام الهدف تحديد الحقول التي تبدو فيها الخلايا البطانية الفلورية الزاهية سليمة. ثم اضبط معلمات الاستحواذ للغشاء YFP و DS RED كما هو موضح للتو في fira two.

مع الحرص على أن يتراوح متوسط شدة إشارة الفلورسنت في كل قناة بين 25 و 75٪ من النطاق الديناميكي للكاشف. قبل إجراء تجربة تصوير الخلايا الحية ، التقط عدة فترات من صور الخلايا البطانية وحدها لإنشاء خط أساس باستخدام البرنامج الآلي. ثم إدخال طرف وحدة تخزين صغيرة في الوسائط بالقرب من مركز الهدف.

قم بتوزيع خمسة ميكرولترات من الفيرا المركزة ببطء ، واثنين من الخلايا الليمفاوية المحملة في وسط مجال تصوير طبق المجهر. عندما تستقر الخلايا الليمفاوية ، قم بإجراء تعديلات دقيقة على التركيز لضمان الحفاظ على واجهات الخلايا البطانية للخلايا التائية في المستوى البؤري. مع أهداف 40 و 63 × ، تكون 10 إلى 20 خلية لكل حقل هي الأمثل.

بعد فترة المراقبة المطلوبة، استمر في التصوير وقم بسحب CIN على الفور مباشرة في طبق المجهر إلى تركيز نهائي قدره اثنين من الميكرومولار للحث على أقصى حد لتدفق الكالسيوم. إشارتان. عند تطبيق العلاجات على الخلايا ، احرص على الحفاظ على التركيز الحاد على سطح الغشاء القمي YFP المسمى للبطانة لضمان الدقة المثلى لإعادة تشكيل المشبك المناعي.

في حالة عدم وجود مستضد فائق على المستضد البطاني الفائق المحدد ، تنتشر الخلايا الليمفاوية الأربعة الإيجابية TH ، وتنتشر بسرعة ، وتستقطب وتهاجر بشكل جانبي فوق الخلايا البطانية. خلال هذه العملية ، تمتد الخلايا الليمفاوية النتوءات قصيرة العمر أو ILPs إلى السطح البطاني ، والتي تظهر كحلقات من غشاء YFP يضان مماثلة لآثار الأقدام في وجود مستضد فائق ، ترتبط الاتصالات القريبة من الخلايا بالخلايا التي يقودها ILPs ببدء تدفق الكالسيوم مما يؤدي إلى تراكم ILPs المستقرة داخل المشبك المناعي. تقترن مصفوفات ILP هذه بإشارات الكالسيوم المستدامة.

تتوافق حلقات التألق الغشائي التي تتشكل أثناء تفاعلات الخلايا البطانية للخلايا التائية مع نتوءات الخلايا التائية التي تقود بقع غزو منفصلة في الخلايا البطانية كما أكد العرض التوضيحي أن هذه الحلقات ترتبط مكانيا وحركيا بمناطق السيتوبلازم النازحة والمستبعدة. في غضون دقائق من الحضانة المشتركة للخلايا البطانية والتائية في وجود التصاق المستضد الفائق وجزيئات الإشارات المرتبطة بالإشارات المستضدية يتم إثراء كوين داخل مطبوعات بوتا و ILPs للمشبك المناعي. في الواقع ، يظهر المشبك المناعي البطاني للخلية التائية بنية ثلاثية الأبعاد سرية تتخللها ILPs للخلايا التائية تمتد إلى سطح الخلية المقدم للمستضد الذي يتم من خلاله إثراء الآلية الجزيئية للتعرف على المستضد.

باستخدام هذا النهج ، يمكن التغلب على العقبات الرئيسية داخل نماذج الكمبيوتر الحالية ، مما يسمح بمراقبة البنية الخلوية ثلاثية الأبعاد التي لا يمكن اكتشافها وإعادة التشكيل السريع لواجهات T للخلايا التائية الفسيولوجية. هذا يوفر إمكانية لمستويات جديدة من فهم عمليات الإشارات المستضدية.