طرق لنقل المترجمة على وجه التحديد من الخلايا أو الحمض النووي في Postimplantation المبكر أجنة الفئران

الهدف العام من هذه الإجراءات هو توضيح كيفية نقل الخلايا أو الحمض النووي بدقة إلى أجنة الفئران المبكرة بعد الزرع. يمكن أن تساعد هذه الأساليب في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء التنموي ، مثل اختبار الإمكانات في الجسم الحي للخلايا المزروعة في المختبر ووظائف جينات معينة في مراحل جنينية محددة. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنيات في أنها لا تتطلب أي معدات متخصصة وتجعل التلاعب التجريبي في وقت مبكر من مزرعة فأر بريو ممكنا بعد التضحية بأنثى حامل في اليوم E 7.5 أو E 8.5 وفقا لبروتوكول النص ، استخدم المقص والملقط لعزل الرحم ووضعه في طبق 30 ملم مملوء بمتوسط M اثنين مع زوجين من الملقط الناعم.

بتمزيق عضل الرحم بعناية ، ثم قشر العشرات ، مع الحرص على عدم ثقب التجاويف الجنينية الزائدة. قم بإزالة غشاء الريكر باستخدام ملقط لقرصه وفصله ببطء عن الجنين. ثم تحت مجهر تشريح استريو ، افحص الأجنة للتأكد من أن السلى الكيس والصفار ومخروط المشيمة سليمان باستخدام ماصة ، انقل الأجنة إلى طبق نظيف من M اثنين وضعها على غطاء طبق بتري بلاستيكي مقاس 30 ملم على الجليد أو منصة جليدية لتبريد الأجنة جزئيا.

تحضير وسط الاستزراع والأجنة المزروعة وفقا لبروتوكول النص لتطعيم الخلايا المستزرعة في أجنة الفئران. ابدأ باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لكشط الخلايا الجذعية للأحجار الكريمة ، والتي تعبر في كل مكان عن GFP من لوحة مزرعة بستة آبار. انقل الخلايا إلى الطبق الذي يحتوي على الأجنة.

قم بتوصيل شعيرات دموية مسحوبة يدويا بأنبوب الشفاط لعمل ماصة الفم تمتص ماصة الفم برفق لسحب كتلة خلوية واحدة أو أكثر من 20 خلية في الشعيرات الدموية للتطعيم. ثم قم بتفجير الخلايا برفق لتفريق الكتل الكبيرة. حدد كتلة واحدة تحتوي على حوالي 10 إلى 20 خلية واسحبها إلى الشعيرات الدموية للتطعيم.

مرة أخرى ، الحفاظ على الكتلة بالقرب من فتحة الشعيرات الدموية باستخدام زوج من الملقط. أمسك الجنين في مكانه بشكل غير محكم وأدخل الشعيرات الدموية في منطقة الاهتمام. لإنشاء فتحة.

طرد الكتلة برفق من الشعيرات الدموية للتطعيم ، مع ترك الخيط القصير المكونة من 10 إلى 20 خلية مستقرة في الجنين. اترك الأجنة في نفس طبق متوسط M two واستخدم مركب فلوري لتشريح المجهر والكاميرا لتصوير الأجنة المطعمة. حافظ على وقت التصوير إلى الحد الأدنى لتجنب تعرض الأجنة للضوء والحرارة المفرطين.

مباشرة بعد التصوير باستخدام عجينة ، قم بنقل الأجنة بحجم بسيط من M اثنين متوسط إلى وسط استزراع متوازن مسبقا ومزرعة وفقا للإرشادات الواردة في بروتوكول النص قبل إجراء تجارب التثقيب الكهربائي ، استخدم ماصة أفقية دقيقة قطبية لسحب ماصات حقن الحمض النووي بطرف رفيع وفتحة أقل من 10 ميكرومتر لتجنب تلف الأنسجة. بالنسبة للتثقيب الكهربائي للشعيرات الدموية الزجاجية، استخدم حدادة دقيقة لقطع فتحة ماصات حقن الحمض النووي بقطر داخلي يبلغ 20 أو 30 ميكرومتر بطرف نظيف وبدون حواف مكسورة. قم بتوصيل كل قطب كهربائي من البلاتين بسلك رفيع معزول وأدخله في حامل إبرة الحقن الدقيق المغطى بشريط عازل.

لتحضير قطب كهربائي شعري مصنوع يدويا ، أدخل سلكا بلاتينا بقطر 0.2 ملم في شكل شعري زجاجي كهربائي بفتحة ثابتة يبلغ قطرها 20 أو 30 ميكرومتر. لتركيز التيار الكهربائي وتوصيل الحمض النووي للبلازما إلى منطقة صغيرة ذات أهمية في الجنين. لعمل قطب كهربائي على شكل حرف L ، قم بثني سلك بلاتيني قطره 0.2 ملم ، مما يؤدي إلى إنشاء شكل L مع الجزء الأفقي من L بطول حوالي ملليمتر واحد.

قم بتركيب حاملات الإبر على حاملات أدوات المعالجة الدقيقة القياسية. قم بتوصيل القطب الشعري بأنود مصدر الطاقة. قم بتوصيل القطب الكهربائي على شكل حرف L بأنود المقياس المتعدد.

ثم قم بتوصيل كاثود المقياس المتعدد بكاثود مصدر الطاقة. املأ الشعيرات الدموية الزجاجية للتثقيب الكهربائي ب PBS في حدود واحد إلى ملليمترين من الأعلى وأدخل القطب البلاتيني المستقيم في الشعيرات الدموية الزجاجية حتى يصل إلى قاع الشعيرات الدموية. قم بتثبيت القطب الكهربائي على شكل حرف L على سطح طبق بتري مقاس 30 ملم المليء ببرنامج تلفزيون.

استخدم مضخة بيكو هوائية لحقن الحمض النووي. أدخل إبرة الحقن من البلاستة الجانبية في التجويف الأمنيوسي للجنين وحقن ما يقرب من خمسة ميكرولترات من محلول الحمض النووي في التجويف أو حتى يمتلئ تماما. احرص على عدم انفجار الجنين.

ثم ضع الجنين بعناية بين الأقطاب الكهربائية وحرك القطب الشعري إلى الموقع الدقيق حيث سيتم تسليم الحمض النووي. باستخدام 200 فولت في ستة نبضات مدة كل منها 50 مللي ثانية ، قم بالكهرباء للجنين بفاصل زمني واحد بين كل نبضة. انقل الجنين على الفور إلى وسط مزرعة متوازن مسبقا قبل تكرار التثقيب الكهربائي للجنين التالي.

الكشف عن الخلايا الحية أو الميتة الكهربائية بعد ساعتين من التثقيب الكهربائي. وفقا لبروتوكول النص الموضح هنا ، يوجد جنين به epi PSCs يعبر في كل مكان عن EGFP مطعمة على E 7.5 ويتم استزراعها خارج الجسم الحي لمدة 24 ساعة. عندما تم تطعيم 10 إلى 16 fscs في أجنة E 7.5 ، تم دمجها وتكاثرها جيدا داخل الجنين المضيف.

ومع ذلك ، فإن تطعيم المزيد من الخلايا لا يؤدي إلى خيم أفضل وينتج عنه في الواقع كتل غير مدمجة كما هو موضح هنا. كما هو موضح في هذا التثقيب الكهربائي ل GFP الذي يعبر عن البلازميدات. تم الكشف عن الخلايا الإيجابية ل GFP بعد ساعة إلى ساعتين من التثقيب الكهربائي.

عندما تم تزويد خلايا البلاستة البعيدة في المرحلة البدائية المتأخرة بالجنين بالكهرباء ، ساهمت الخلايا المسماة في الجلد العصبي بعد 24 ساعة في الثقافة ، وهو ما يتوافق مع خرائط المصير المعروفة لخلايا الهجرة في أجنة مرحلة المعدة. يوضح هذا الشكل أنه على غرار استخدام أنواع أخرى من الأقطاب الكهربائية للتثقيب الكهربائي ، تسبب القطب الشعري أيضا في درجة معينة من موت الخلايا في المنطقة المستهدفة. نظرا لأن هذه المنطقة بدت أغمق في اللون مقارنة بالمناطق المجاورة ، حيث قامت بتسمية نوى الخلايا الميتة بغشاء غير منفذ ، فإن اللون الأحمر البعيد الفلور يموت

أكد أن تقنية التثقيب الكهربائي الشعري ينتج عنه عدد قليل فقط من الخلايا الميتة بالقرب من موقع التثقيب الكهربائي. أثناء محاولة هذه الإجراءات ، من المهم البدء في زراعة الأجنة في غضون ساعتين. بعد عزل الرحم عن الفئران في نهاية المزرعة ، يمكن إصلاح الأجنة.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل تقسيم التلوين من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل مساهمة المتبرع أو الخلايا المضفرة الكهربائية في الأجنة المضيفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لدينا فهم جيد لكيفية نقل الخلايا بدقة إلى أجنة الفئران المبكرة بعد الزرع.