Name: عالية الإنتاجية دانيو Rerio طاقة الإنفاق الفحص (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: اكتشف تقييم معدل الأيض في يرقات سمك الزرد باستخدام مؤشر أكسدة الريدوكس alamar Blue. تتيح هذه الطريقة عالية الإنتاجية فحص التأثيرات الدوائية والجينية على التوازن الطاقي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتورين روجر كون وتشاو تشانغ على مساهماتهم في التحقق من صحة تطبيق هذا الاختبار كما تم نشره سابقا. تم دعم هذا العمل من قبل NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

ملاحظة: هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية للجامعة أريزونا مكتب للسلوك المسؤول من البحوث وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي 1. تربية اسماك الزرد والصيانة الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد E3 المتوسط ​​الجنين 8. جعل 60X حل سهم، ويحل 34.8 غرام كلوريد الصوديوم، 1.6 غرام بوكل، 5.8G CaCl 2 ● 2H 2 O، و9.78 ز MgCl 2 ● 6H 2 O في 1.95 L ddiH 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك ضبط مستوى الصوت إلى 2 لتر باستخدام ddiH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد 1X E3 المتوسط ​​الجنين، وتمييع 16.5 مل 60X الأسهم في 1 L ddiH20. إضافة 100 ميكرولتر 1٪ الميثيلين الأزرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منزل ذكر وأنثى الأسهم الحضنة (7-18 شهرا من العمر) على حدة لتحقيق أقصى قدر من الخصوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الأنوار 1-2 ساعة قبل يوم قبل أن يتم المطلوب البيض. إعداد التزاوج (1 الذكور و1-2 إناث) في جأقفاص rossing كما هو موضح سابقا 9. أقفاص عبور تسمح للبيض للهروب الافتراس لأنها تمر من خلال قاعدة مثقبة من إدراج دبابات التي تقام في الأسماك البالغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: لتربية الموقوتة، (كما ستكون هناك حاجة لدراسات شملت morpholino حقن)، فصل الذكور والإناث الأسماك التي كتبها مقسم البلاستيك الشفاف، إزالة هذا في الصباح أن يؤدي إلى زرع توقيت البيض والإخصاب. لmorpholino الدراسات وإجراء عمليات حسابية القدرة على تقييم عدد من الأسماك الجنينية المطلوبة لكل معاملة. دون تقدير لحجم تأثير أو الاختلاف، يمكن تشغيل محاكمة الأولية مع ن = 8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب البيض من القفص معبر في طبق بتري (100-150 الأجنة / 10 سم طبق بتري). السماح للبيض لتستقر في قاع الطبق وتخلصي من الماء. إزالة أي المياه المتبقية باستخدام طرف غرامة نقل المتاح ماصة. إضافة مرة أخرى E3 المتوسط ​​الجنين في الخطوة 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل بالعربيةعرجاء ماصة المتاح مصقول للبيضة في المستقبل، ونقل الأسماك. باستخدام مقص، وقطع نقل المتاح ماصة تخرج في تخريج 0.25 مل. لإزالة حواف خشنة، والبولندية لهب قطع أكثر من طرف على موقد بنسن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الأسماك الجنينية إلى 4 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) في 10 سم أطباق بتري في الزرد المتوسطة E3 الجنين في 28.5 ○ C. كل يوم مرتين، واستخدام اللهب مصقول تخرج نقل المتاح ماصة لإزالة أي بويضة غير مخصبة أو الأجنة الميتة (ظهور الأبيض مبهمة). مرة واحدة كل يوم، استبدال E3 المتوسط ​​الجنين. تخلصي E3 المتوسط ​​الجنين، وإزالة السائل المتبقي باستخدام طرف غرامة نقل المتاح ماصة، وإضافة مرة أخرى قبل تحسنت (28.5 ○ C) E3 المتوسط ​​الجنين. </li></ol> 2. إعداد الفحص الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول الفحص وفقا للجدول 1. محلول معقم مرشح فحص باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر. قبل لفحص بدء، تدفئة حل فحص العقيمة في 28.5 ○ Cحمام الماء. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عنصر </td><td> ٪ من إجمالي </td><td> الحجم (ميكرولتر / 10 مل) </td></tr><tr><td> 60X E3 الأجنة المتوسطة </td><td> 1،667 </td><td> 166.7 </td></tr><tr><td> منزوع الأيونات المزدوج (DDI) H 2 0 </td><td> 96،233 </td><td> 9623.3 </td></tr><tr><td> الامار الأزرق </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 ملي هيدروكسيد الصوديوم </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الفحص المتوسطة 3. إجراء الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأجنة الزرد 3 مرات مع العقيمة التي تمت تصفيتها E3 المتوسط ​​الجنين. الجمع بين جميع الأجنة الزرد قابلة للحياة من مخلب في دورق. تصفية العقيمة 75 مل E3 المتوسط ​​الجنين. باستخدام طرف غرامة نقل المتاح ماصة، وإعادةنقل أكبر قدر من المتوسط ​​الجنين E3 من الأجنة الزرد وقت ممكن. إضافة إلى الوراء 20 مل العقيمة التي تمت تصفيتها E3 المتوسط ​​الجنين. إزالة واستبدال E3 المتوسط ​​الجنين 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 1 الأسماك في كل من 93 بئرا من الأسود 96-جيدا وقفت أسفل لوحة واضحة. نقل الأسماك الجنينية لوحة من قبل التقاط فردي الجنين داخل اللهب مصقول تخرج من البلاستيك القابل للتصرف نقل ماصة (الخطوة 1.5) وإخراج بلطف في البئر. نقل E3 المتوسط ​​الجنين المأخوذة من دورق يحتوي على الأسماك تشطف في 3 آبار فارغة. هذا يضمن أن بئر فارغة تعرضوا لنفس الماء بالضبط كما الآبار التي تحتوي على الأسماك. يجب على الآبار التي تحتوي على الأسماك والآبار فارغة تكون على الاقل ½ الكامل (200 ميكرولتر) في ختام هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال E3 الجنين المتوسطة مع الحل فحص في جميع الآبار 96، بما في ذلك آبار فارغة. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة 1 عمود في وقت لكل من الأعمدة 12 في 96 لوحة جيدا. باستخدام طرف غرامة التخلص منها عبرفر ماصة، وإزالة E3 المتوسط ​​الجنين من كل جيدا في عمود واحد من لوحة (8 آبار). الحرص على عدم لمس الجنين الزرد. إضافة 300 ميكرولتر من محلول الفحص على كل جانب من التي تمت إزالة المياه. تكرار إزالة E3 المتوسط ​​الجنين واستبدال مع حل فحص لجميع الأعمدة 12 لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: لاختبار تغير معدل الأيض ردا على المجمع، وجعل الحل الذي هو 100 مرات (100X) تركيز العلاج المطلوب. من المذكرة، وضمان أن الحل 100X لا يتجاوز 10٪ DMSO للحد من تركيز DMSO النهائية بما لا يزيد عن 0.1٪. إضافة 3 ميكرولتر من الحل 100X إلى كل من الآبار العلاج. ملاحظة: إجراء العمليات الحسابية القدرة على تقييم عدد من الآبار العلاج. ومع ذلك، من دون تقدير لحجم الاستجابة أو الاختلاف، يمكن تشغيل محاكمة تمهيدية في 8 مجمع المعالجة و8 مركبة تعامل آبار المراقبة التي تحتوي على الأسماك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 ميكرولتر من السيطرة على السيارة لسيطرة (لا دروز العلاج) الآبار التي تحتوي على الأسماك. لضمان الاستجابة الفلورسنت إلى المركب هو نتيجة للإجراءات داخل الأسماك، وتطبيق العلاجات الدوائية والمركبات إلى 3 آبار فارغة في 96 لوحة جيدا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة الأسماك شغل وحة على قارئ لوحة الفلورسنت مع الطول الموجي الإثارة في 530 نانومتر والطول الموجي الانبعاثات في 590 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان لوحة في حاضنة ترطيب مجموعة إلى 28.5 ○ C (الحفاظ على لوحة في الظلام طوال فحص لتجنب photobleaching من محلول الفحص). يمكن تشغيل مقايسة لفترات من الزمن تتراوح من 1 ساعة إلى 24 ساعة. مدة الاختبار يعتمد على الهدف من الدراسة. لاختبار استجابة لمركب غير مستقر قصير المفعول قد تكون قصيرة المدة الأنسب. بعد، لاختبارات مجمع مستقرة أو اختبارات التأثيرات الجينية، وتعظيم مدة الفحص هو الأفضل لاستغلال المزايا المرتبطة إشارة تراكمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نقطة زمنية محددة مسبقا (انظر الخطوة 3.6 للمساعدة في تحديد التوقيت)قراءة مضان لوحة مليئة الأسماك مرة أخرى مع نفس الإعدادات كخطوة 3.5. </li></ol> 4. تقييم التغير النسبي في الإسفار أسوشيتد مع العلاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب التغير في مضان من كل بئر من خلال طرح مضان في وقت 0 من مضان في ختام الدراسة. يجب آبار بلا الأسماك (الفراغات) لديها قيم بالقرب من 0، أقل بكثير من القيم من الآبار التي تحتوي على الأسماك. تغيير في الإسفار = الإسفار في ختام - مضان في وقت 0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتأكد من التغير النسبي في مضان، وحساب متوسط ​​التغير في مضان لآبار المراقبة ثم يقسم التغير في مضان من كل بئر من متوسط ​​التغير في مضان من آبار المراقبة. وتجدر الإشارة، يمكن التحكم تكون إما الضوابط سيارة أو الضوابط الوراثية. <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545(2014).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+energy+metabolism.+Proton+permeability+of+the+inner+membrane+of+liver+mitochondria+is+greater+in+a+mammal+than+in+a+reptile%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile.</a> Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).</li>
<li>Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+assay+for+high-throughput+energy+expenditure+monitoring+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish.</a> Zebrafish. 10, 343-352 (2013).</li>
<li>Livingston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+volumetric+respirometer+for+long-term+studies+of+small+aquatic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.Mar.+Biol.+Assoc.+U.K%22%5BJournal%5D)">A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals.</a> J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).</li>
<li>Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-animal+microplate+assay+for+metabolic+rate+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish.</a> J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).</li>
<li>E3 medium (for zebrafish embryos) Cold Spring Harb. Protoc. , <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449">http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449</a> (2011).</li>
<li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53, 161-168 (2012).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%2C+A+practical+approach%22">Zebrafish, A practical approach</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Fry, F. E. J., Hart, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cruising+speed+of+goldfish+in+relation+to+water+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish.+Res.+Board+Can%22%5BJournal%5D)">Cruising speed of goldfish in relation to water temperature.</a> J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).</li>
<li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+physiol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC physiol. 10 (21), (2010).</li>
<li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).</li>
<li>Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+insulin+resistance+in+zebrafish+induces+alterations+in+beta-cell+number+and+glucose+tolerance+in+an+age+and+diet+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+physiol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner.</a> Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio).</a> J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PloS one. 7, e52549(2012).</li>
<li>Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+obesogenic+test%3A+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة للإفصاح عنها.

سوف التلوث بالبكتيريا أو الفطريات يحد بشكل كبير من تطبيق هذا الاختبار. الأزرق الميثيلين في المتوسط ​​الجنين E3 يحد من إمكانية التلوث الفطري. في جميع أنحاء الجنين تربية فمن الأهمية بمكان أن الرعاية التي اتخذت لإزالة الأجنة الميتة مرتين كل يوم. بالإضافة إلى ذلك، فمن الضروري أن يشطف جيدا الأجنة مع E3 العقيمة المتوسط ​​الجنين في يوم الفحص بدء. هذه الخطوات من 2 إلى الحد من احتمالات التلوث الجرثومي للأجنة. إدراج الآبار فارغة هو موضح في الخطوة 3.2 يسمح للكشف عن أي تلوث بكتيري. التلوث الج...

الفأر هو حاليا النموذج السائد للأبحاث السمنة. كانت فترة جيل قصيرة والأدوات الجينية المتاحة في الماوس لا مثيل لها حتى الآن. ومع ذلك، فقد الزرد أيضا فاصل الجيل قصيرة (3-4 أشهر)، ويفوق حتى الماوس في سهولة التلاعب الجيني 1،2. يحافظ على الزرد ما يقرب من 90٪ من الجينات الثدييات، في حين يتجاوز بكثير الماوس في عدد من ذرية والإمكانات للاستخدام في شاشات الوراثية والمخدرات 3. للاستفادة من إمكانات من طراز الزرد للدراسات في السمنة، ويجب وضع المقايسات للتحقيق في العوامل التي تؤثر على تنظيم وزن الجسم، بما في ذلك نفقات الطاقة. كما تتم معالجة الأيض من خلال β للأكسدة وحمض الكربوكسيليك دورة الأكسجين ويستهلك وينتج NADH 2. وهكذا، NADH 2 هو مؤشر مباشر على تدفق الأيض من خلال المسارات الأيضية (التمثيل الأيضي الأكسدة). في poikilotherms، H + تسرب من خلال غشاء الميتوكوندريا الداخلية، التي uncouples NADH 2 الأكسدة من ATP التوليف، هو 4-5 أضعاف أقل مما كانت عليه في متجانسات الحرارة 4. وفقا لذلك، في NADH الزرد 2 يرتبط بإحكام جدا لإنتاج ATP من خلال الفسفرة التأكسدية. هنا، نحن تصف مقايسة الذي يقيس NADH 2 الإنتاج في الزرد اليرقات كوكيل للإنفاق الطاقة 5. استهلاك الأوكسجين هو المعيار الذهبي لقياس استهلاك الطاقة. ومع ذلك، وإلى الاستفادة القصوى من إمكانيات إنتاجية عالية من الزرد، ويجب أن تكون المقايسات من نفقات الطاقة قابلة للالإنتاجية العالية. نظم استهلاك الأوكسجين التي تعتمد على غرفة مغلقة تعميم نظام محدودة في الإنتاجية من قبل عدد من الغرف المتاحة 6. فتح O الهواء 2 استهلاك / CO 2 فحوصات الإنتاج كما تم تطبيقه في الزرد 5،7. هذه 96-جيدا في الهواء الطلق لوحة قاعدةنظم د قابلة للإنتاجية عالية. للأسف، تبادل الغازات مع البيئة يحد حساسية هذه المقايسات. نشرنا مؤخرا تطبيق مقايسة التي تراقب NADH 2 باستخدام مؤشر الأكسدة alamarBlue 5. هذا الاختبار يتغلب على القيود في سرعة وحساسية مشتركة لتحليل استهلاك الأوكسجين في الزرد. الزرد أصبحت نموذجا متزايد الأهمية للدراسات كله توازن الطاقة في الجسم. في جزء منه، لأن الزرد هي قابلة للاستخدام في شاشات الوراثية إلى الأمام وشاشات المخدرات. وعلاوة على ذلك، تستهدف التلاعب الجيني، بما في ذلك ضربة قاضية واضعا في، ويمكن تطبيقها بسرعة. لقد أظهرنا سابقا أن هذا الاختبار يمكن دمجه مع تطبيق حمام المخدرات وضربة قاضية وراثية أو خروج المغلوب لتحديد المركبات والجينات التي تغير معدل الأيض 5. وعلاوة على ذلك، تم تصميم هذا الاختبار لاستغلال مزايا الإنتاجية العالية المتأصلة في الزرد. </P&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>المصنعة بواسطة Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fine Tip يمكن التخلص منهاTransfer Pipette</td><td>Fisher Scientific Scientific</td><td>13-711-26</td><td>المصنعة بواسطة Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>المصنعة بواسطة Thermo Scientific</td></tr> أسود <tr><td>الجوانب صفيحة قاع شفافة 96 بئر</td><td>فيشر Scientific</td><td>50-320-785</td><td>المصنعة بواسطة E & شركة K Scientific Products Inc.</td></tr></tbody></table>

عالية الإنتاجية<em&gt; دانيو rerio</em&gt; طاقة الإنفاق الفحص

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

الزرد هي كائن نموذجا هاما مع المزايا الكامنة التي لديها القدرة على جعل الزرد نموذجا يطبق على نطاق واسع لدراسة توازن الطاقة والسمنة. صغر حجم الزرد يسمح لفحوصات على الأجنة التي ستجري في شكل لوحة 96- أو 384-جيدا والتكنولوجيات Morpholino وكريسبر أساس تعزيز سهولة التلاعب الجيني، والعلاج من تعاطي المخدرات من خلال تطبيق الحمام غير قابلة للحياة. وعلاوة على ذلك، الزرد مثالية لشاشات الوراثية إلى الأمام السماح لاكتشاف الجين الرواية. نظرا لحداثة النسبية للالزرد كنموذج للسمنة، فمن الضروري لتطوير الأدوات التي تستغل بشكل كامل هذه الفوائد. هنا، نحن تصف طريقة لقياس استهلاك الطاقة في الآلاف من الزرد الجنينية في وقت واحد. قمنا بتطوير كامل منصة صفيحة ميكروسكوبية الحيوانات التي نستخدمها لوحات 96-جيدا لعزل الأسماك الفردية ونقيم التراكمي إنتاج NADH 2 باستخدام المتاحة تجاريا زراعة الخلايا جدوى إعادةوكيل alamarBlue. في متغيرات الحرارة ترتبط بإحكام العلاقة بين NADH 2 إنتاج واستهلاك الطاقة. هذا الاختبار نفقات الطاقة يخلق القدرة على الشاشة بسرعة التلاعب الدوائية أو الوراثية التي تغير مباشرة نفقات الطاقة أو تغيير الاستجابة لدواء التطبيقية (على سبيل المثال محسسات الأنسولين).

حل الاختبار لا يزيد مضان في غياب الأسماك الجنينية (الشكل 1). ومع ذلك، فإن فحص حساس جدا لتغيرات صغيرة في معدل الأيض داخل البئر. سمكة واحدة داخل بئر يخلق إشارة مختلفة إلى حد كبير من الآبار فارغة في حدود 1 ساعة (P &lt;0.0001). الشكل 2 يوفر التمثيل البصري من الإشارات التي تولدها الأسماك الجنينية بعد 24 ساعة من الحضانة. لغرض هذه الصورة استخدمت الآبار جانب واضحة. بعد، ويفضل الآبار جانب السوداء لأداء الاختبار لمنع الرشح من إشارة الفلورسنت من الآبار القري...

Zebrafish هي كائن حي نموذجي مهم لدراسة توازن الطاقة. من خلال استخدام مؤشر الأكسدة والاختزال الحساس NADH2 ، alamar Blue ، قمنا بتطوير اختبار يقيس معدل الأيض ليرقات الزرد في شكل 96 لوحة بئر ويمكن تطبيقه على اكتشاف الأدوية أو الجينات.

عالية الإنتاجية<em&gt; دانيو Rerio</em&gt; طاقة الإنفاق الفحص

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

الهدف العام من هذا المقايسة الفلورية عالية الإنتاجية القائمة على الريسازورين هو مراقبة تأثير التلاعبات الجينية أو الدوائية على إنتاج NADH2، والذي يعد مقياساً لمعدل الأيض. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال السمنة، مثل تأثير دواء معين أو جين معين على معدل الأيض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطبيق هذه المقايسة لفحص التفاعلات المحتملة بين دواء ودواء آخر أو بين دواء وجين في نظام حيواني كامل.تتمثل الميزة الرئيسية لهذا المقايسة، مقارنة بمقايسات استهلاك الأكسجين، في الإنتاجية العالية وتراكم الإشارة بمرور الوقت، مما يتيح للمستخدم اكتشاف فروق طفيفة في معدل التمثيل الغذائي. ستقوم كارولين فوي، طالبة دراسات عليا في مختبري، بشرح هذا الإجراء. بعد تحضير محلول مخزون بتركيز 60X من وسط E3 وفقاً للبروتوكول المكتوب، قم بتحضير وسط E3 بتركيز 1X عن طريق تخفيف 16.5 milliliters من المحلول المخزون في لتر واحد من الماء المقطر مرتين.ثم أضف 100 µL من methylene blue بتركيز 1%. ولصنع ماصة نقل استعمالات واحدة مصقولة باللهب لنقل البيض والأسماك، استخدم المقص لقص ماصة نقل مدرجة استعمالات واحدة عند علامة 0.25 mL. ثم، لإزالة الحواف الخشنة، استخدم موقد بنزن لصقل الطرف المقطوع باللهب.بعد إعداد تزاوجات سمك الزيبرا وجمع البيوض، اترك البيوض حتى تستقر في قاع الطبق، ثم قم بتصريف المياه. استخدم ماصة نقل ذات طرف رفيع وقابلة للتخلص منها لإزالة أي مياه متبقية. بعد ذلك، أضف وسط E3 مرة أخرى.تُحضن أجنة الأسماك عند درجة حرارة 28.5 °C حتى اليوم الرابع بعد الإخصاب (DPF). يُستخدم مرتين يومياً ماصة نقل مدرجة ذات استخدام واحد ومصقولة باللهب لإزالة أي بيوض غير مخصبة أو أجنة ميتة. بعد ذلك، يتم سكب وسط E3 مرة واحدة يومياً.استخدم ماصة نقل ذات رأس دقيق لإزالة أي وسط متبقٍ، واستبدله بوسط E3 طازج تم تدفئته مسبقاً إلى 28.5 degrees Celsius. ولإجراء مقايسة استهلاك الطاقة، قم بتحضير محلول المقايسة وفقاً لهذا الجدول. استخدم مرشحاً بمسامية 0.22 micrometer لتعقيم المحلول بالترشيح، وقم بتدفئته إلى 28.5 degrees Celsius في حمام مائي قبل بدء المقايسة.في طبق بتري، اجمع كل أجنة أسماك الزيبرفيش القابلة للحياة من الحضنة. بعد تعقيم 75 ملليلتر من وسط E3 بالترشيح، استخدم ماصة نقل ذات طرف دقيق مخصصة للاستخدام مرة واحدة لإزالة أكبر قدر ممكن من وسط E3 من طبق بتري. ثم أضف 20 ملليلتر من وسط E3 المعقم. كرر عملية إزالة واستبدال وسط E3 المعقم مرتين إضافيتين.بعد ذلك، وباستخدام ماصة نقل بلاستيكية مدرجة ووحيدة الاستخدام مصقولة باللهب، انقل أجنة الأسماك بشكل فردي إلى آبار صفيحة ذات 96 بئرًا. وبالعمل على عمود واحد من الصفيحة في كل مرة، قم بإزالة وسط E3 من الآبار الثمانية في العمود الأول، مع الحرص على عدم لمس الأجنة بماصة النقل. ثم أضف 300 µL من محلول المقايسة إلى كل بئر.كرر العملية مع جميع الأعمدة الاثني عشر في الطبق. ولإدراج معالجة دوائية، بعد تحضير محلول بتركيز 100X من المركب المطلوب، أضف 3 µL إلى كل بئر من آبار المعالجة. ثم أضف 3 µL من عامل التحكم المذيب (vehicle control) إلى آبار التحكم الخاصة بالأسماك.لضمان أن الاستجابة الفلورية للمركب هي نتيجة للنشاط داخل الأسماك، قم بإعداد معالجات الدواء والناقل في ثلاث آبار فارغة لكل منها في لوحة ذات 96 بئرًا. الآن، باستخدام قارئ لوحات الفلورية، بطول موجي للإثارة يبلغ 530 نانومتر وطول موجي للانبعاث يبلغ 590 نانومتر على التوالي، اقرأ آبار لوحة الأسماك. ضع اللوحة في حاضنة مرطبة عند 28.5 درجة مئوية.بناءً على نوع المقايسة واستقرار المركب الذي يتم اختباره، قم بقراءة الفلورة مرة أخرى عند نقطة زمنية محددة مسبقاً. ولتقييم التغير النسبي في الفلورة، احسب متوسط التغير في الفلورة لآبار التحكم. ثم اقسم التغير في الفلورة لكل بئر على متوسط التغير في الفلورة لآبار التحكم.إليك مثال على استخدام عمودين من طبق يحتوي على 96 بئراً. تشمل آبار العمود A أسماك الزيبرا الضابطة المعالجة بالناقل، بينما تشمل آبار العمود B أسماك الزيبرا المعالجة بالأنسولين. يوضح الجدول A قياسات الفلورة عند الزمن صفر.يحتوي الجدول B على قياسات الفلورة التي تم رصدها بعد 24 ساعة. وفي الجدول C، تم طرح قيمة الفلورة عند الزمن صفر من قيمة الفلورة عند 24 ساعة لتقييم التغير في الفلورة. بعد ذلك، احسب متوسط التغير في الفلورة في آبار التحكم.يمثل الجدول D التغير في الفلورة لكل بئر على حدة، مقسوماً على متوسط التغير في آبار التحكم. يمكن ملاحظة أن المعاملة بالأنسولين بتركيز 10 micromolar أدت إلى زيادة بمقدار 2.77 ضعفاً في الإشارة الناتجة عن zebrafish على مدار 24 ساعة، بقيمة P أقل من 0.0001. وكما هو موضح هنا، فإن محلول المقايسة لا يتغير لونه أو مستويات الفلورة المطلقة في غياب الأجنة.ومع ذلك، فإن هذا المقايسة حساسة للغاية للتغيرات الطفيفة في معدل الأيض داخل البئر. يمثل هذا الشكل الإشارات الناتجة عن أجنة أسماك البلطي بعد تحضينها لمدة 24 ساعة. وتشير الآبار ذات اللون الوردي إلى الأسماك ذات معدل الأيض المرتفع.تحتوي الآبار الأرجوانية على أسماك ذات معدلات أيض متوسطة، بينما تمثل الآبار الزرقاء معدل أيض منخفض. وهذا يوضح أيضاً تعدد استخدامات هذا المقايسة وتطبيقه عبر أنواع الأسماك العظمية. ونظراً لأن اختزال alamar blue الناجم عن NADH2 غير عكسي، فإن الإشارة تتراكم مع مرور الوقت، مما يسمح بتضخيم التغيرات الطفيفة.يظهر هنا التغير النسبي في الفلورة الناتج عن وجود سمكة واحدة إلى خمس أسماك عند ساعة وساعتين وأربع ساعات. ومع كل زيادة في عدد الأسماك، يزداد التغير النسبي في الفلورة بشكل ملحوظ مع مرور الوقت، وكلما زاد عدد الأسماك، زاد مقدار التغير في الفلورة بمرور الوقت. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تطبيقها على ما يصل إلى 5,000 من أجنة الأسماك يومياً.عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر توخي الحذر لتجنب إيذاء أجنة الأسماك. بعد إجراء هذا المقايسة، يمكن تنفيذ إجراءات أخرى مثل قياس الدهون المتعادلة باستخدام صبغة Nile red، أو قياس دافع التغذية من خلال تناول البراميسيوم المسمى بمقايسة فلورية. يتيح لنا ذلك مقارنة العلاقة بين معدل الأيض وأيض الدهون، أو بين معدل الأيض ودافع التغذية.بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال استقلاب الطاقة وأمراض التمثيل الغذائي لدراسة إنفاق الطاقة في سمك الزيبرا دون قيود في القدرة الإنتاجية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية استخدام الكاشف الفلوري resazurin لقياس إنتاج NADH2 في سمك الزيبرا.

high-throughput-danio-rerio-energy-expenditure-assay

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

الزرد الفقاريات تمثل نموذجا القوية التي كانت غير مستغلة للدراسات التمثيل الغذائي. نحن هنا وصف وسيلة سريعة...

الأيض تحليل الملف من الأجنة الزرد

&lt; p class = 'jove_content'&gt; تم وصف بروتوكول للكشف في الجسم الحي عن تأثيرات مثبطات الميتوكوندريا في الكائن الحي النموذجي Caenorhabditis elegans ولتحديد المركبات المعززة المحتملة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لفحص مكتبات الأدوية بحثا عن مركبات تعدل وظيفة الميتوكوندريا.

A للمسح<em&gt; في فيفو</em&gt; الفحص للالميتوكوندريا المغيرون في الموجة الكهرومغناطيسية عن طريق المعدلة وراثيا للإضاءة الحيوية<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

هذا نظام غذائي الدهون عالية التغذية البروتوكول للحث على السمنة في المورفولوجية، نموذجا لفهم الآليات الجزيئية الأساسية المتورطين في ليبوتوكسيسيتي. كما يوفر مقايسة ترياسيلجليسيريدي إنتاجية عالية لقياس تراكم الدهون في أخرى يحتمل أن تكون نماذج (الحشرات) تحت مختلف الظروف الغذائية أو البيئية أو الوراثية أو الفسيولوجية و المورفولوجية .

تغذية حمية الدهون عالية وإنتاجية عالية بالانزيم ترياسيلجليسيريدي في Melanogaster المورفولوجية

نقدم بروتوكولا لقياس استهلاك الأوكسجين وتحمض خارج الخلية في العقول melanogaster المورفولوجية اليرقات والكبار. ويستخدم هو محلل ايضية مع بروتوكولا مدروسا والأمثل. القيود الأنسجة الدقيقة هي عنصر حاسم لهذا البروتوكول وصممت وأنشئت خصيصا لاستخدامها في هذا التحليل.

التحليل الأيضي اليرقات melanogaster المورفولوجية و "العقول الكبار"

ويصف هذا الأسلوب تسجيل الوقت الحقيقي لاستهلاك الأوكسجين ومعدلات تحمض خارج الخلية في أنسجة الشبكية الماوس اكسبلانتيد محلل تدفق خارج الخلية باستخدام.

قياس استقلاب الطاقة في اكسبلانتيد نسيج الشبكية باستخدام تحليل الجريان خارج الخلية

التنفس المتقدرية أمر حاسم لبقاء العضوي؛ ولذلك، معدل استهلاك الأوكسجين مؤشرا ممتازا للصحة المتقدرية. في هذا البروتوكول، يمكننا وصف استخدام ريسبيروميتير المتاحة تجارياً لقياس القاعدية ومعدلات استهلاك الأوكسجين القصوى في العيش، سليمة، وبحرية متحركة ايليجانس كاينورهابديتيس.

قياس معدلات استهلاك الأوكسجين في سليمة ايليجانس كاينورهابديتيس

هنا ، نحن نميز استجابات الإجهاد البرودوسلي الخلوي في النيماتودا C. elegans من خلال قياس تنشيط المراسلين النسخ الفلوريو وحساسية الإجهاد الفسيولوجي.

قياسات استجابات الإجهاد الفسيولوجي في C. Elegans

تقدم هذه الدراسة بروتوكولات لنهجين شبه آليين لتحليل النشاط الحركي في C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms ، وهما ZebraLab (وهو مقايسة متوسطة الإنتاجية) وWormScan (وهو مقايسة عالية الإنتاجية) وتوفر تحليلا مقارنا بين مجموعة واسعة من طرق البحث لتحديد سلوك النيماتودا والوظيفة العصبية العضلية المتكاملة.

تحليل مقارن للطرق التجريبية لقياس النشاط الحيواني في نماذج Elegans Caenorhabditis من مرض الميتوكوندريا

يوفر المقايسة المغذية microplate طريقة اقتصادية عالية الإنتاجية لقياس استهلاك الأغذية السائلة في Drosophila. يربط جهاز مطبوع ثلاثي الأبعاد لوحة صغيرة من 96 بئرا يتم فيها إيواء الذباب بصحونة صغيرة من 1536 بئرا يستهلك منها الذباب محلول تغذية بصبغة متتبعة. يتم قياس انخفاض حجم الحل الطيفيمقطيا.

A عالية الإنتاجية ميكروبليت المغذية المقايسة للقياس الكمي للاستهلاك في Drosophila

قد تؤثر ميكروبات الأمعاء بشكل إيجابي أو سلبي على صحة مضيفها من خلال آليات محددة أو محفوظة. Caenorhabditis elegans هي منصة ملائمة لفحص مثل هذه الميكروبات. يصف البروتوكول الحالي الفحص عالي الإنتاجية ل 48 عزلة بكتيرية للتأثير على مقاومة إجهاد الديدان الخيطية ، ويستخدم كبديل لصحة الديدان.

فحص عالي الإنتاجية للعزلات الميكروبية مع التأثير على صحة Caenorhabditis elegans

يصف هذا البروتوكول مقايسة لتحديد معدل تغذية Caenorhabditis elegans بناء على قياس إزالة البكتيريا في الثقافة السائلة.

قياس كمية الطعام في Caenorhabditis elegans عن طريق قياس التخليص البكتيري

اكتشف تقييم معدل الأيض في يرقات سمك الزرد باستخدام مؤشر أكسدة الريدوكس alamar Blue. تتيح هذه الطريقة عالية الإنتاجية فحص التأثيرات الدوائية والجينية على التوازن الطاقي.

عالية الإنتاجية

استكشف المزيد من الفيديوهات