التهجين الكامل في الموقع
التهجين الكامل في الموقع هو تقنية شائعة تستخدم لتصور موقع الحمض النووي الريبي المعبر عنه في الأجنة. في هذه العملية ، ترتبط مجسات الحمض النووي الريبي ا…
التهجين الكامل في الموقع هو تقنية قوية تمكن العلماء من فهم الأساس الجزيئي للتطور الجنيني. يشير "التثبيت الكامل" إلى أنه سيتم استخدام الجنين بأكمله ، وليس مجرد شريحة من الأنسجة. "في الموقع" هي عبارة لاتينية تعني "في الموقف". وأخيرا ، يشير مصطلح "التهجين" إلى الارتباط التكميلي لجزيء الحمض النووي الريبي المنتج صناعيا بنسخة mRNA داخل خلية الكائن الحي.
سيوضح هذا الفيديو الإجراء والنتائج المتوقعة والتطبيقات المختارة لهذه التقنية التي يمكن أن تسمح بفهم أفضل لاضطرابات النمو.
يتم التعبير عن الجينات الكامنة وراء تشكل الكائن الحي في أنماط مقيدة زمانيا ومكانيا أثناء التطور الجنيني.
تستخدم مجسات الحمض النووي الريبي المنتجة صناعيا ، والتي تسمى الريبوبروبس ، للكشف عن mRNAs عن طريق الارتباط التكميلي. يتم تصنيف الريبوبروبات بالنيوكليوتيدات الخاصة التي تحتوي على "هابتين" ، مثل ثنائي نيتروفينول أو البيوتين أو الديجأكسيجين. الهابتن هي جزيئات يمكن أن تثير استجابة مناعية عند ربطها بجزيئات أكبر ، وبالتالي فهي أهداف لربط الأجسام المضادة. تترافق هذه الأجسام المضادة للكشف مع إنزيمات ، مثل بيروكسيداز الفجل الحار أو الفوسفاتيز القلوي ، التي تحفز التفاعلات الكيميائية حيث يمكن ترسيب صبغة فلورية أو ملونة.
تتطلب تقنيات التهجين التقليدية في الموقع تحضير أقسام الأنسجة من الجنين لتسهيل الكشف عن الهياكل الداخلية. نتيجة لذلك ، يجب إعادة بناء تقييم كامل للتعبير الجيني في جميع أنحاء الكائن الحي من شرائح الأنسجة 5-6 ميكرومتر بمساعدة برامج الكمبيوتر. ومع ذلك ، مع تطوير تقنيات التثبيت الكامل ، يمكن الحصول على تحليل التعبير الجيني عبر مسافات أكبر داخل الجنين بأكمله.
بعد النظر في المبادئ الكامنة وراء التهجين الكامل في الموقع ، دعنا ننتقل إلى البروتوكول التجريبي خطوة بخطوة.
تتضمنالخطوة الأولى في هذا الإجراء تحديد التسلسل المستهدف في الكائن الحي النموذجي المراد فحصه. ثم يتم تضخيم تسلسل الحمض النووي المستهدف بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات تحتوي على تسلسلات بدء بوليميراز الحمض النووي الريبي. يتم الآن نسخ قالب الحمض النووي المضخم في المختبر باستخدام النيوكليوتيدات ذات العلامات الهابتين. هذا الريبوبار الذي يحمل علامة hapten جاهز الآن لخطوة التهجين.
يتم تحضير الأجنة للتهجين عن طريق التثبيت باستخدام الفورمالديهايد ، وهو كاشف متقاطع يعمل على استقرار البروتينات ويحمي من RNases. بعد التثبيت ، تتم إزالة الفورمالديهايد عن طريق غسل الجنين عدة مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات يحتوي على كمية صغيرة من المنظفات ، مثل Tween. لإزالة الدهون الخلوية وتسهيل تغلغل المسبار في الأنسجة ، يتم تجفيف الأجنة في سلسلة متدرجة من غسول الميثانول ، على سبيل المثال: 25٪ ، 50٪ ، 75٪ ، 100٪ ميثانول. يمكن حفظ الأجنة في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة تصل إلى شهر واحد (أو أكثر) عند -20 درجة مئوية.
لتحضير الأجنة للتهجين ، يجب إعادة ترطيبها بسلسلة متدرجة من غسول الميثانول مع كمية أقل من الميثانول تدريجيا لكل غسلة. ثم يتم هضم الأجنة باستخدام البروتياز لتسهيل انتشار الريبوبروب في الأنسجة. يضاف المسبار الريبي المسمى إلى الجنين ويتم إجراء التهجين.
يتم إجراء غسالات ما بعد التهجين لإزالة التهجين غير المحدد. تتم إضافة RNases A و T1 لإزالة المجسات المهجنة بشكل غير كامل عن طريق هضم الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة. يتم الكشف عن المجسات المهجنة باستخدام مترافق إنزيم الأجسام المضادة الذي يربط الريبوبروبات ذات العلامات الهابتين. كما ذكرنا سابقا ، يتم اقتران الإنزيمات مثل الفوسفاتيز القلوي مع الأجسام المضادة الخاصة بالهابتن ، ويتم اكتشافها عن طريق إضافة ركائز إنزيمية لاستنباط تغير اللون. يشكل ناتج التفاعل راسب أرجوانيا داكنا يشير إلى موقع الرنا المرسال المعبر عنه ، كما هو موضح في هذا المثال.
الآن بعد أن عرفت كيفية القيام بالتهجين الكامل في الموقع ، دعنا نلقي نظرة على بعض تطبيقات هذه التقنية.
تم استخدام التهجين الكامل في الموقع لمساعدة العلماء على معالجة الأمراض الفتاكة التي ينقلها البعوض ، مثل الملاريا وحمى الضنك ومرض غرب النيل. من خلال توصيف الجينات المشاركة في تكاثر البعوض وتطوره ، يمكن تصميم مبيدات حشرية بيولوجية أو كيميائية جديدة لاستهداف البعوض الحامل للأمراض بشكل أفضل.
يتضمن تطبيق آخر لهذه التقنية توصيف تغييرات نمط التعبير الجيني المرتبطة بالتعرض للمسخيات ، أو العوامل التي تتداخل مع نمو الجنين.
هنا ، تم استخدام التهجين الكامل في الموقع في نموذج أسماك الزرد لمتلازمة الكحول الجنينية لتحديد الجينات التي تتغير أنماط التعبير عنها بعد التعرض للكحول. يمكن أن يساعد ذلك في تطوير علاجات للتخفيف من عواقب التعرض للكحول في الرحم.
يمكن أيضا استخدام التهجين الكامل في الموقع للتحقق من صحة التغيرات المظهرية المرتبطة بالأمراض الخلقية. تم إدخال الطفرات المرتبطة بمتلازمة بارديت بيدل في أجنة أسماك الزرد عبر الحمض النووي الريبي الطافرة المنتجة صناعيا. بعد فترة زمنية محددة ، تم تقسيم الأجنة إلى مجموعات بناء على شدة العيوب. تم استخدام تصور التعبير عن الجينات في اتجاه مجرى الجين المتحور للتحقق من صحة التغيرات المظهرية. وبالتالي ، فإن التهجين الكامل في الموقع بالاشتراك مع التسجيل الظاهري يمكن أن يسهل فهما أفضل لأدوار الطفرات المحددة الكامنة وراء عيوب النمو.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE على التهجين في الموقع بالكامل. هذه التقنية هي أداة قوية تتيح التوصيف الزمني والمكاني الدقيق للتعبير الجيني داخل الكائن الحي. يتم حاليا استخدام التهجين الكامل في الموقع لإنشاء أطلس لأنماط التعبير الجيني أثناء التطور في العديد من الكائنات الحية النموذجية. قد تسهل هذه الدراسات تطوير علاجات جديدة لعلاج الأمراض التي تصيب الإنسان ، بما في ذلك السرطان. شكرا للمشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
التهجين الكامل في الموقع هو تقنية قوية تمكن العلماء من فهم الأساس الجزيئي للتطور الجنيني. يشير "التثبيت الكامل" إلى أنه سيتم استخدام الجنين بأكمله ، وليس مجرد شريحة من الأنسجة. "في الموقع" هي عبارة لاتينية تعني "في الموقف". وأخيرا ، يشير مصطلح "التهجين" إلى الارتباط التكميلي لجزيء الحمض النووي الريبي المنتج صناعيا بنسخة mRNA داخل خلية الكائن الحي.
سيوضح هذا الفيديو الإجراء والنتائج المتوقعة والتطبيقات المختارة لهذه التقنية التي يمكن أن تسمح بفهم أفضل لاضطرابات النمو.
يتم التعبير عن الجينات الكامنة وراء تشكل الكائن الحي في أنماط مقيدة زمانيا ومكانيا أثناء التطور الجنيني.
تستخدم مجسات الحمض النووي الريبي المنتجة صناعيا ، والتي تسمى الريبوبروبس ، للكشف عن mRNAs عن طريق الارتباط التكميلي. يتم تصنيف الريبوبروبات بالنيوكليوتيدات الخاصة التي تحتوي على "هابتين" ، مثل ثنائي نيتروفينول أو البيوتين أو الديجأكسيجين. الهابتن هي جزيئات يمكن أن تثير استجابة مناعية عند ربطها بجزيئات أكبر ، وبالتالي فهي أهداف لربط الأجسام المضادة. تترافق هذه الأجسام المضادة للكشف مع إنزيمات ، مثل بيروكسيداز الفجل الحار أو الفوسفاتيز القلوي ، التي تحفز التفاعلات الكيميائية حيث يمكن ترسيب صبغة فلورية أو ملونة.
تتطلب تقنيات التهجين التقليدية في الموقع تحضير أقسام الأنسجة من الجنين لتسهيل الكشف عن الهياكل الداخلية. نتيجة لذلك ، يجب إعادة بناء تقييم كامل للتعبير الجيني في جميع أنحاء الكائن الحي من شرائح الأنسجة التي يتراوح طولها بين 5 و 6 أمتار بمساعدة برامج الكمبيوتر. ومع ذلك ، مع تطوير تقنيات التثبيت الكامل ، يمكن الحصول على تحليل التعبير الجيني عبر مسافات أكبر داخل الجنين بأكمله.
بعد النظر في المبادئ الكامنة وراء التهجين الكامل في الموقع ، دعنا ننتقل إلى البروتوكول التجريبي خطوة بخطوة.
تتضمن الخطوة الأولى في هذا الإجراء تحديد التسلسل المستهدف في الكائن الحي النموذجي المراد فحصه. ثم يتم تضخيم تسلسل الحمض النووي المستهدف بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات تحتوي على تسلسلات بدء بوليميراز الحمض النووي الريبي. يتم الآن نسخ قالب الحمض النووي المضخم في المختبر باستخدام النيوكليوتيدات ذات العلامات الهابتين. هذا الريبوبار الذي يحمل علامة hapten جاهز الآن لخطوة التهجين.
يتم تحضير الأجنة للتهجين عن طريق التثبيت باستخدام الفورمالديهايد ، وهو كاشف متقاطع يعمل على استقرار البروتينات ويحمي من RNases. بعد التثبيت ، تتم إزالة الفورمالديهايد عن طريق غسل الجنين عدة مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات يحتوي على كمية صغيرة من المنظفات ، مثل Tween. لإزالة الدهون الخلوية وتسهيل تغلغل المسبار في الأنسجة ، يتم تجفيف الأجنة في سلسلة متدرجة من غسول الميثانول ، على سبيل المثال: 25٪ ، 50٪ ، 75٪ ، 100٪ ميثانول. يمكن حفظ الأجنة في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة تصل إلى شهر واحد (أو أكثر) عند -20 درجة مئوية.
لتحضير الأجنة للتهجين ، يجب إعادة ترطيبها بسلسلة متدرجة من غسول الميثانول مع كمية أقل من الميثانول تدريجيا لكل غسلة. ثم يتم هضم الأجنة باستخدام البروتياز لتسهيل انتشار الريبوبروب في الأنسجة. يضاف المسبار الريبي المسمى إلى الجنين ويتم إجراء التهجين.
يتم إجراء غسالات ما بعد التهجين لإزالة التهجين غير المحدد. تتم إضافة RNases A و T1 لإزالة المجسات المهجنة بشكل غير كامل عن طريق هضم الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة. يتم الكشف عن المجسات المهجنة باستخدام مترافق إنزيم الأجسام المضادة الذي يربط الريبوبروبات ذات العلامات الهابتين. كما ذكرنا سابقا ، يتم اقتران الإنزيمات مثل الفوسفاتيز القلوي مع الأجسام المضادة الخاصة بالهابتن ، ويتم اكتشافها عن طريق إضافة ركائز إنزيمية لاستنباط تغير اللون. يشكل ناتج التفاعل راسب أرجوانيا داكنا يشير إلى موقع الرنا المرسال المعبر عنه ، كما هو موضح في هذا المثال.
الآن بعد أن عرفت كيفية القيام بالتهجين الكامل في الموقع ، دعنا نلقي نظرة على بعض تطبيقات هذه التقنية.
تم استخدام التهجين الكامل في الموقع لمساعدة العلماء على معالجة الأمراض الفتاكة التي ينقلها البعوض ، مثل الملاريا وحمى الضنك ومرض غرب النيل. من خلال توصيف الجينات المشاركة في تكاثر البعوض وتطوره ، يمكن تصميم مبيدات حشرية بيولوجية أو كيميائية جديدة لاستهداف البعوض الحامل للأمراض بشكل أفضل.
يتضمن تطبيق آخر لهذه التقنية توصيف تغييرات نمط التعبير الجيني المرتبطة بالتعرض للمسخيات ، أو العوامل التي تتداخل مع نمو الجنين.
هنا ، تم استخدام التهجين الكامل في الموقع في نموذج أسماك الزرد لمتلازمة الكحول الجنينية لتحديد الجينات التي تتغير أنماط التعبير عنها بعد التعرض للكحول. يمكن أن يساعد ذلك في تطوير علاجات للتخفيف من عواقب التعرض للكحول في الرحم.
يمكن أيضا استخدام التهجين الكامل في الموقع للتحقق من صحة التغيرات المظهرية المرتبطة بالأمراض الخلقية. تم إدخال الطفرات المرتبطة بمتلازمة بارديت بيدل في أجنة أسماك الزرد عبر الحمض النووي الريبي الطافرة المنتجة صناعيا. بعد فترة زمنية محددة ، تم تقسيم الأجنة إلى مجموعات بناء على شدة العيوب. تم استخدام تصور التعبير عن الجينات في اتجاه مجرى الجين المتحور للتحقق من صحة التغيرات المظهرية. وبالتالي ، فإن التهجين الكامل في الموقع بالاشتراك مع التسجيل الظاهري يمكن أن يسهل فهما أفضل لأدوار الطفرات المحددة الكامنة وراء عيوب النمو.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE على التهجين في الموقع بالكامل. هذه التقنية هي أداة قوية تتيح التوصيف الزمني والمكاني الدقيق للتعبير الجيني داخل الكائن الحي. يتم حاليا استخدام التهجين الكامل في الموقع لإنشاء أطلس لأنماط التعبير الجيني أثناء التطور في العديد من الكائنات الحية النموذجية. قد تسهل هذه الدراسات تطوير علاجات جديدة لعلاج الأمراض التي تصيب الإنسان ، بما في ذلك السرطان. شكرا للمشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What does whole-mount in situ hybridization allow scientists to visualize?
Whole-mount in situ hybridization enables visualization of expressed RNA locations throughout an entire embryo. Synthetically produced RNA probes, called riboprobes, bind complementarily to target mRNA transcripts. This reveals spatial and temporal patterns of gene expression across the whole organism, providing insights into developmental genetics techniques and applications.
Q2: How are riboprobes labeled for detection in whole-mount in situ hybridization?
Riboprobes are labeled with special nucleotides containing haptens, such as dinitrophenol, biotin, or digoxygenin. Haptens are molecules that elicit immune responses when attached to larger molecules, making them targets for antibody binding. Detection antibodies conjugated to enzymes like horseradish peroxidase or alkaline phosphatase then catalyze reactions that deposit fluorescent or colored dyes.
Q3: Why is embryo fixation with formaldehyde important before hybridization?
Formaldehyde fixation stabilizes proteins and protects embryos against RNases, which would otherwise degrade RNA. After fixation, embryos are washed with phosphate buffered saline containing detergent to remove formaldehyde. This preparation step ensures the embryo is ready for subsequent dehydration and probe penetration.
Q4: What is the advantage of whole-mount techniques over traditional tissue section methods?
Traditional in situ hybridization requires reconstructing gene expression from 5-6 micrometer tissue slices using computer software. Whole-mount techniques eliminate this limitation by allowing gene expression analysis over larger distances within the entire embryo. This provides a complete assessment of spatial and temporal gene expression patterns without computational reconstruction.
Q5: How are riboprobes generated for whole-mount in situ hybridization?
Target DNA sequences are first identified and amplified by PCR using primers containing RNA polymerase initiation sequences. The amplified DNA template is then transcribed in vitro with hapten-labeled nucleotides to produce labeled riboprobes. These probes are now ready for the hybridization step with embryonic tissues.
Q6: What role do post-hybridization washes play in the technique?
Post-hybridization washes remove nonspecific hybridizations and incompletely bound probes. RNases A and T1 are added to digest single-stranded RNA that did not properly hybridize. This ensures that only specifically hybridized probes remain, improving signal accuracy and reducing background noise in the final detection.
Q7: How is whole-mount in situ hybridization being applied to understand developmental disorders?
Researchers use whole-mount in situ hybridization to characterize gene expression changes associated with teratogens and congenital diseases. In zebrafish models of fetal alcohol syndrome, the technique identified genes with altered expression after alcohol exposure. Combined with phenotypic scoring, it validates how specific mutations underlying developmental defects affect gene expression downstream.