تحديد أكسيد المعادن النانوية في العينات النسيجية من خلال تعزيز بمجهر ذي ساحة مظلمة المجهري الطيفي ورسم الخرائط

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الجسيمات النانوية لأكسيد المعادن في العينات النسيجية عن طريق المجهر المجهري للمجال المظلم ورسم الخرائط الفائق الطيفي. يتم تحقيق ذلك من خلال تحديد منطقة الاهتمام أولا في عينة تحكم إيجابية تحتوي على جسيمات نانوية والتقاط صورة مجال مظلم. الخطوة الثانية هي إنشاء صورة فائقة الطيف أو مكعب بيانات للمنطقة ذات الاهتمام باستخدام الكاميرا الفائقة الطيفية.

بعد ذلك ، يتم إنشاء مكتبة طيفية مرجعية من مكعب بيانات التحكم الإيجابي ، والذي يتم تصفيته مقابل عنصر تحكم سلبي لإزالة أي إيجابيات خاطئة. الخطوة الأخيرة هي استخدام المكتبة الطيفية المرجعية لرسم الخرائط مقابل العينات التجريبية لتحديد وتحديد الجسيمات النانوية من نفس التركيبة. يتم استخدام الفحص المجهري للمجال المظلم المحسن في نهاية المطاف ورسم الخرائط الفائقة الطيفية لتحديد جزيئات أكسيد المعادن النانوية في العينات النسيجية بطريقة أسرع وأقل كثافة في الموارد من التقنيات الأخرى مثل المجهر الإلكتروني.

تقدم هذه الطريقة العديد من المزايا مقارنة بتقنيات التصوير والتوصيف التقليدية للمواد النانوية مثل المجهر الإلكتروني. في هذا التحضير للعينة عادة ما يكون ضئيلا وغير مدمر. يستغرق الحصول على الصور وتحليلها وقتا أقل وتكلفة، ويمكن تطبيقه لتصوير الجسيمات النانوية في مجموعة متنوعة من المصفوفات.

عرف الأفراد أن المنهجية تكافح أحيانا لأن إنشاء عينات التحكم الإيجابية المناسبة والمكتبات الطيفية المرجعية يمثل تحديا ويستغرق وقتا طويلا. ولكن بمجرد اكتمال هذه الخطوات الأولية ، يمكن تقييم العينات التجريبية بسرعة كبيرة. في حين أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على الاختراق الجلدي للجسيمات النانوية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على عينات بيولوجية أخرى مثل غسل القصبات الهوائية ومسحات الدم ، بالإضافة إلى العينات غير البيولوجية ، مثل المرشحات المستخدمة في تقييمات التعرض المهني.

سيظهر هذه التقنية بلار سوسا ، طالب طب من مختبري ، ابدأ عن طريق توصيل وتشغيل مصدر الضوء ، ووحدة التحكم في المسرح ، والكاميرا البصرية ، والكاميرا الفائقة الطيفية ، ونظام الكمبيوتر. ثم ارفع المسرح والمكثف إلى وضع التشغيل وقم بتطبيق ثلاث إلى خمس قطرات من زيت الغمر من النوع A بعناية على عدسة المكثف. إذا تم إنشاء أي فقاعات ، امسح الزيت وأعد وضعه على العدسة.

بعد ذلك ، ضع العينة على المسرح وارفع المكثف ببطء حتى يتلامس زيت الغمر مع الجانب السفلي للشريحة. سيكون هذا ملحوظا من خلال حلقة الإضاءة سريعة السطوع حيث يتلامس الزيت مع الشريحة. مع وضع المكثف في مكانه ، قم بالتبديل إلى الهدف 10 × ثم قم بتركيز المكثف ومحاذاته لزيادة السطوع إلى أقصى حد إذا لزم الأمر ، اضبط مقابض محاذاة المكثف لتوسيط النقطة المضيئة.

افتح برنامج التصوير البصري. ركز العينة باستخدام مقبض التركيز البؤري الموضوعي الدقيق. ثم ابحث عن منطقة الاهتمام.

اضبط تركيز المكثف حسب الضرورة لموازنة الإضاءة. انقر فوق علامة تبويب الإعدادات في شريط القائمة وانقر على زر التقاط الصورة. لحدث الالتقاط.

حدد تنسيق الصورة المطلوب وقم بتعيين اسم ملف للصورة. بالإضافة إلى ذلك ، حدد قيمة الفاصل الزمني الافتراضية ، وأخيرا انقر فوق موافق. بعد ذلك ، انتقل إلى قائمة التعريض الضوئي وحدد إعدادات التعريض الضوئي التي تنشئ صورة أعلى تباين.

هنا ، يتم ضبط المستوى على 0.0٪ يتم ضبط الكسب على 2.8 ديسيبل ويتم ضبط سرعة الغالق على 56 مللي ثانية. التقط الصورة بالنقر فوق زر الصورة في شريط القائمة. قم بتغيير الهدف إلى 40 x و100 x.

التقاط الصور بتكبير أعلى ، وتأكد من توجيه دليل الضوء إلى الكاميرا الفائقة الطيفية ، ثم افتح برنامج التصوير الفائق الطيفي للحصول على مكعبات بيانات HSI في البرنامج ، افتح المجهر الفائق الطيفي في شريط القائمة وحدد عناصر التحكم في مجهر HSI. هنا قم بتعيين التكبير الموضوعي والمسار الآمن. بعد ذلك ، قم بتغيير التقاط المنطقة في الإعدادات ، وقم بتغيير عدد الخطوط.

في هذه الدراسة استخدمنا 720 ضبط وقت التعرض. هنا استخدمنا 0.25 ثانية. اترك كل شيء آخر افتراضيا وانقر فوق معاينة HSI لعرض الصورة.

لاحظ الرسم البياني للشدة الناتج الذي يمثل شدة أعلى طول موجي أثناء تحرك المستخدم عبر المحور x لمركز مجال الكاميرا. حرك المؤشر لإنشاء مخطط تفصيلي دقيق للرسم البياني. سيؤدي ذلك إلى ظهور مؤشر كثافة عددية على اليسار.

قم بتركيز الصورة بناء على هذه المعاينة عن طريق ضبط التركيز البؤري الموضوعي الدقيق لزيادة وضوح القمم في هذه الصورة. بعد ذلك ، قم بتحسين شدة الضوء عن طريق ضبط تركيز مكثف سطوع المصدر ، أو إلغاء المعاينة وضبط وقت التعرض في البرنامج. انقر فوق الالتقاط ولاحظ كأربع نوافذ جديدة بالأسماء المتاحة.

قائمة النطاقات. التكبير رقم واحد. رقم واحد ، يظهر التمرير ورقم واحد نطاق RGB.

قم بتكبير نافذة نطاق RGB رقم واحد لأن هذا هو مكعب البيانات ، والذي سيتم استخدامه لجميع المراجع المستقبلية. يمين؟ انقر فوق مكعب البيانات هذا ، واحفظه كملف tiff وانقر فوق موافق. انقر بزر الماوس الأيمن في نافذة صورة مكعب البيانات وانقر بزر الماوس الأيسر على طيف ملف تعريف Z.

عندما تظهر نافذة ملف التعريف الطيفي المنبثقة على اليسار ، انقر فوق وحدات البكسل ذات الأهمية على هدف مكعب البيانات. ألمع الفئات هي تلك التي يمكن تحديدها بثقة على أنها تمثل المادة ذات الأهمية. ضمن قائمة تحليل الجسيمات ، حدد أداة تصفية الجسيمات لتحديد الجسيمات الموجودة في مكعب البيانات.

في مجموعة النوافذ المنبثقة الجديدة ، يجب أن يتجاوز الحد الأقصى الطيفي القيمة ، لذا فهو أعلى من وحدات البكسل في الخلفية ، ولكنه أقل من المواد ذات الأهمية. الحد الأقصى للبيانات الصالحة هو 16,000. في نافذة أداة مراجعة عامل تصفية الجسيمات ، انقر فوق تحديد الكل.

ثم انقر فوق تصدير إلى المكتبة الطيفية وقم بتعيين اسم المكتبة الطيفية. بعد اختيار عينة لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي ، احصل على عدة مكعبات بيانات من العينة. باستخدام الكاميرا الفائقة الطيفية ، يلزم وجود كاميرا واحدة على الأقل ، ولكن يمكن التقاط المزيد.

لزيادة الانتقائية مع فتح مكعب بيانات التحكم السلبي ، انقر فوق المكتبة الطيفية لعامل التصفية ضمن قائمة التحليل الموجودة على شريط أدوات البرنامج الرئيسي ، انقر فوق فتح ملف جديد وحدد المكتبة الطيفية التي تم إنشاؤها مسبقا لعنصر التحكم الإيجابي كملف الإدخال ، انقر فوق موافق. في نافذة المكتبة الطيفية cyto viva. انقر فوق الصورة واختر اسم ملف الإخراج للمكتبة الطيفية المرجعية ، وانقر فوق موافق.

بعد ذلك ، انقر فوق اسم ملف مكعب بيانات التحكم السلبي كصورة مصدر. سيقوم البرنامج بتحليل المكتبة الطيفية وإزالة كل طيف يطابق أي طيف من مكعب بيانات التحكم السلبي. الحصول على مكعبات البيانات من العينات التجريبية مع فتح مكعب البيانات التجريبية.

انقر فوق القائمة الطيفية في القائمة الفرعية لطرق التعيين افتح مخطط الزاوية الطيفية. حدد اسم مكعب البيانات التجريبي في النافذة المنبثقة، وانقر فوق موافق. إذا لم يتم إدراج أسماء ملفات، فانقر فوق فتح ملف جديد واختر مكعب البيانات التجريبي.

ثم انقر فوق موافق في النافذة المنبثقة المسماة End Member collection ، SAM ، انقر فوق استيراد في شريط القائمة. ثم حدد من ملف المكتبة الطيفية. افتح المكتبة الطيفية المرجعية التي تم إنشاؤها مسبقا، وانقر فوق موافق.

في النافذة المنبثقة الجديدة المسماة مكتبة الإدخال الطيفي، انقر فوق تحديد جميع العناصر، وانقر فوق موافق. ثم انقر بزر الماوس الأيمن على اللون وحدد. قم بتطبيق الألوان الافتراضية على الكل ، انقر فوق تحديد الكل متبوعا بتطبيق ، ثم اختر اسم ملف الإخراج وانقر فوق موافق.

افتح قائمة التراكب في نافذة مكعب البيانات وحدد التصنيف. ثم انتقل إلى اسم ملف الإخراج وانقر فوق موافق. في قائمة نافذة أداة الفئة التفاعلية، افتح قائمة الخيارات وحدد دمج الفئات لإنشاء نظام ألوان موحد.

لتسهيل تحليل البيانات باستخدام برامج أخرى ، حدد طيفا واحدا من قائمة الفئات الأساسية. ثم حدد جميع الفئات باستثناء غير مصنفة لدمجها في القاعدة. ثم انقر فوق موافق.

بعد ذلك ، انقر فوق اللون الأساسي المحدد وستظهر جميع الأطياف المطابقة بهذا اللون. للحصول على صورة amatic التي ستظهر الأطياف المطابقة على خلفية سوداء ، انقر فوق مربع الألوان غير المصنفة ، وهو أسود بشكل افتراضي ، تتمثل أهم ميزة لهذه التقنية في قدرتها على تحديد جزيئات أكسيد المعادن النانوية في العينات النسيجية عن طريق المجهر المجهري للمجال المظلم ورسم الخرائط الفائق الطيفي. توضح هذه الصور هذه العملية باستخدام عينات الجلد النسيجية.

في حين أن بعض الجسيمات واضحة بسهولة في المجال المظلم ، يتم اكتشاف الصورة البصرية وجسيمات إضافية باستخدام التصوير الفائق الطيفي. يظهر هنا أنسجة جلد الخنازير في طبقة البشرة ، والتي تعرضت لجزيئات Illumina النانوية. تم العثور على مجموعة عالية التباين من الجسيمات النانوية مترسبة فوق طبقة القرنية في الطبقة الجلدية ، والتي تعرضت لجزيئات السيليكا النانوية.

يمكن رؤية الجسيمات النانوية المتعددة عالية التباين تترسب فوق النسيج الضام. أخيرا ، في الأنسجة تحت الجلد ، التي تعرضت للجسيمات النانوية السورية. يمكن رؤية الجسيمات النانوية المتعددة المشتتة عالية التباين تترسب على طول تحديد الجسيمات النانوية للخلايا الشحمية باستخدام هذه الطريقة.

في عينات الأنسجة الأخرى مثل الرئة والكبد والطحال والكلى والغدد الليمفاوية ممكن. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تحليل الصور من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل عدد الجسيمات وموقع الجسيمات. يجب الموازنة بين بعض الاعتبارات والعيوب مثل الحاجة إلى ضوابط عالية التخصص والقيود المفروضة على دقة التصوير الضوئي مع تلك الخاصة بالطرق التقليدية.

عند اختيار أنسب التقنيات التحليلية للتحقيق في أسئلة بحثية محددة ، اخترنا إثبات هذا التطبيق المعين لأنه لديه القدرة على استكمال أبحاث السموم النانوية الحالية والمستقبلية. يمكن أن يعلم أيضا البحث فيما يتعلق بامتصاص الجسيمات النانوية وتوزيعها واستقلابها وإفرازها في جميع أنحاء الأعضاء والأنسجة.