التحقق من صحة نموذج الفأر لعرقلة ينك مجمعات بطريقة خلية محددة

الهدف العام من هذه التجربة هو توضيح فائدة نموذج الفأر المعدل وراثيا ، مما يسمح بالتعبير المحفز والمستهدف لذاكرة التخزين المؤقت EGFP ذات العلامات الفلورية ، واثنين من الببتيد في الجسم الحي ، والاضطراب الناتج عن مجمعات الارتباط الذاتية. في هذه التجربة ، سيتم استهداف التعبير عن ذاكرة التخزين المؤقت ذات العلامات الفلورية لخلايا بيركين المخيخية. يمكن أن يعالج هذا النهج الجيني الأسئلة الرئيسية حول دور مجمعات الارتباط في تحديد المواقع النووية داخل معظم الأنسجة المختلفة.

التعبير المحفز والمستهدف ل E-G-F-P-K TWO له العديد من المزايا. أولا ، يتطلب مخطط تربية واحد لفئران الكاي مع أي سلالة كروز موجودة. ثانيا ، يتجاوز هذا النهج التطور في الفترة المحيطة بالولادة التي لوحظت في نماذج الفئران لطفرات السلالة الجرثومية لمكونات الارتباط المعقدة.

أخيرا ، تسمح هذه الطريقة بدراسة فسيولوجيا مجمعات الارتباط داخل خلايا أو أنسجة معينة. في الجسم الحي. ستوضح لك كلوي بوتر ، وهي عضو في المختبر ، الخطوات المختلفة المطلوبة لتصور E-G-F-P-K اثنين في خلايا Burkin G المخيخية.

للبدء ، قم بتربية فئران clac Z مع PCP اثنين من الفئران CRE لإنتاج PCP اثنين CAG C وفئران كما هو موضح في المنشورات السابقة. عندما تولد الجراء الناتجة ، قم بإجراء التنميط الجيني. لتحديد أولئك الذين يؤوون كل من الجينات المعدلة وراثيا EGFP و Cree كما هو موضح سابقا ، قم بإعداد 50 مل من محلول السكروز بنسبة 30٪ في PBS وتخزينه عند سالب 20 درجة مئوية حتى يوم حصاد الأنسجة في العمر المناسب ، وقم بإجراء نضح القلب العابر للفئران تحت التخدير من أجل تحضير أنسجة المخ للتشريح كما هو موضح في البروتوكول المكتوب ، ضع الدماغ المقطوع في صفيحة زراعة الأنسجة بطول 10 سم مع 10 ملليلتر من PBS وافصل المخيخ عن المخيخ.

بعد ذلك ، استخدم مشرطا لتشريح المخيخ في المستوى السهمي ونقل الأقسام إلى محلول سكروز بنسبة 30٪ وتخزينه عند أربع درجات مئوية طوال الليل. تحضير ملاط من الثلج الجاف واثنين من ميثيل البيوتان. اترك درجة حرارة الحمام تتوازن لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، املأ قالب التبريد بمركب OCT وضع نصف المخيخ المفصل في القالب باستخدام مجهر تشريح وزوج من الملقط. ضع المخيخ بحيث يكون السطح ثنائي التشريح القريب من خط الوسط للمخيخ متجها لأعلى في القالب. ثم انقل قالب التبريد إلى ملاط العين الجافة لمدة خمس دقائق حتى يشكل مركب OCT مصفوفة بيضاء صلبة حول عينة الأنسجة.

قم بتخزين العينة المضمنة عند سالب 20 درجة مئوية لحين الحاجة. قم بتسمية شرائح البولي ليسين المعالجة مسبقا لجمع أقسام الأنسجة وتركيب كتلة الأنسجة المخيخية على حامل الأنسجة باستخدام OCT الطازج. بمجرد تثبيت الكتلة بإحكام ، قم بتركيب حامل المناديل وحلق شرائح 40 ميكرومتر لإزالة OCT الزائد حتى يتم الوصول إلى الأنسجة.

اضبط السماكة على 15 ميكرومتر واجمع الأقسام عن طريق الاتصال بعناية بقسم OCT مع الجانب المطلي بالبولي ليسين من الشريحة. قم بتخزين أقسام الأنسجة على درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية حتى الشروع في التلوين والتصوير. عندما تكون جاهزا للمتابعة ، قم بإذابة الأجزاء المخيخية في الظلام لمنع تلاشي البروتينات الفلورية.

باستخدام قلم حاجز كاره للماء ، ارسم مستطيلا حول محيط أقسام الأنسجة. أضف حوالي 500 ميكرولتر من الألدهيد 4٪ إلى الأقسام لمدة خمس دقائق لتثبيت الأنسجة. ثم استخدم الفراغ لشفط المثبت مع الحرص بشكل خاص على عدم إزعاج أقسام الأنسجة باستخدام الماصة.

ضع PBS برفق على الشريحة دون إزعاج أقسام الأنسجة. بعد خمس دقائق ، استخدم الماصة الفراغية لإزالة السائل بعناية ، وكرر شطف PBS ما مجموعه ثلاث مرات. بعد ذلك ، أضف حوالي 500 ميكرولتر من محلول الحجب إلى الشرائح واحتضانها لمدة 10 دقائق.

قم بإزالة محلول الحجب ثم استبداله بنفس المحلول الذي يحتوي على واحد إلى 300 تخفيف إما من الأجسام المضادة أو الأجسام المضادة لربط السعرات الحرارية أو nesin. ثم قم بإزالة محلول الجسم المضاد واشطف الشرائح باستخدام PB S3 مرات. احتضن الشرائح لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

بعد ذلك ، قم بإعداد تخفيف واحد إلى 1000 من أرضية Alexa 5 94 المناهضة للولايات المتحدة للشرائح المسماة بربط البقرة ومضاد Alexa Fluor 5 94 لشريحة Nesprin ذات العلامات في محلول الحظر وقم بتخزين المحاليل في الظلام حتى تكون هناك حاجة إليها. قم بإزالة شطف PBS النهائي برفق وقم بتغطية الأقسام بالأجسام المضادة الثانوية المخففة لمدة ساعة واحدة في الظلام. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد الثانوي.

ثم ضع صبغة نووية مثل DPI عند 300 نانومولار في PBS لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، اشطف الأقسام مرتين أخريين في PBS. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول PBS وقم بتغطية قسم المناديل بقطرة واحدة من وسط التثبيت.

ضع زلة غطاء زجاجي أعلى قسم المناديل الورقية ، وتجنب فقاعات الهواء واتركها جانبا لمدة 15 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ثم استخدم المجهر الفلوري لتصور تلطيخ الأجسام المضادة وبروتينات الفلورسنت. بالنسبة لشرائح المخيخ ، استخدم إما هدف 20 × أو 40 ×.

لعرض الحافين النوويتين E-G-F-P-C كما هو موضح هنا ، يمكن تصور E-G-F-P-C اثنان مباشرة في شرائح المخيخ في قناة Fitzy. علاوة على ذلك ، فإن التوطين المشترك ل EGFP مع ارتباط البقر ، والذي يصنف خلايا بيركين على وجه التحديد ، يؤكد أن تعبيرين E-G-F-P-C يقتصر على خلايا بيركين داخل خلايا بيركين. تستهدف ذاكرة التخزين المؤقت الثانية ل EGFP الغلاف النووي كما هو موضح في أنماط EGFP الموجبة مثل RIM التي لوحظت حول النواة.

في هذا المثال، تم اكتشاف تعبيرين لذاكرة التخزين المؤقت EGFP في أكثر من 70٪ من خلايا بيركين الموجبة المرتبطة بالبقرة. يخبأ EGFP اثنين من إزاحة نسبرين الداخلي من الغلاف النووي من خلال تشبع مجالات الشمس المتاحة. وفقا لذلك ، يتم إزاحة NESIN الثاني الداخلي من الغلاف النووي لخلايا Perkin التي تعبر عن ذاكرة التخزين المؤقت EGFP الثانية.

بينما تحتفظ خلايا بيركين التي لا تعبر عن E-G-F-P-C باثنين من nesin الذاتية في الغلاف النووي كما يتداخل التحكم المتوقع ، والتي لا تعبر عن إعادة تركيب CRE تعرض NESIN اثنين في الغلاف النووي لمجموعة خلايا البكيني بأكملها واحدا. لذلك تتوفر كتل التصوير المقطعي المحوسب من الأنسجة. يمكن تصور E-G-F-P-K اثنين في حوالي أربع ساعات.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن مدى تثبيت PFF و / أو ظروف التضمين يمكن أن يؤثر بشكل كبير على antigeniity في الحاتمة. لذلك من المهم جدا تحديد ظروف التثبيت المثلى التي تحافظ على الحاتمة الخاصة بك. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نموذج الفأر المعدل وراثيا CK لاستهداف التعبير عن الكاجو VGFP لأنسجة معينة.