Name: تقييم الرئة الانبثاث في ماوس الثديية ورم المجموعات بواسطة الكمي في الوقت الحقيقي PCR (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: اكتشف كيفية تقييم الانبثاث الرئوي في الفئران باستخدام تقنية PCR الكمي في الوقت الحقيقي. تتيح هذه الطريقة الكشف الحساس عن الحمض النووي الريبي الخاص بالأورام وتحديد مستوى الانتشار السرطاني بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يتم اعتماد مختبر يه بواسطة تمويل البحوث من الجمعية الأمريكية للسرطان المؤسسية منحة بحثية (IRG-97-219-14) منحت لمركز هولينغ السرطان في MUSC، من خلال تمويل البحوث من منحة وزارة الدفاع (W81XWH-11-2- 0229) في MUSC، وجائزة من القلق مؤسسة (لESY).

بروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية والمعايير رعاية الحيوان من كلية الطب بجامعة ولاية كارولينا الجنوبية (MUSC) ورعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC). 1. الرئة تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثديية تشريح الورم (اختياري اعتمادا على أهداف الدراسة وعما إذا تم إجراء تحليل الورم الرئيسي أو الوريد الذيل حقن). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس باستخدام جرعة قاتلة من التخدير الأيزوفلورين وفقا لIACUC وتنظيم الجامعة. تأكيد euthanization بواسطة الخلع الجراحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على مجلس رغوة، دبوس مع دبابيس تشريح عن طريق وضع الماوس على ظهرها مع انتشار أطرافه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رذاذ الفأر مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط، فهم الجزء السفلي من الحيوان في المركز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص، وقطع في اتجاه تصاعدي الرقبة من خلال الجلد، والحرص على عدم اختراق التجويف البريتوني من الفأرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض الجلد في الأطراف لكشف نسيج الورم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح خارج نسيج الورم والعلاقات العامةeserve بواسطة الأسلوب المفضل، مثل تجميد أو التثبيت، لمزيد من التحليل (لم تناقش بشكل أكبر في هذا البروتوكول). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرئة تشريح الأنسجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان حصادها أنسجة الورم كما هو موضح أعلاه، أحدد أي الجلد الزائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط، فهم البريتوني في أدنى حد من الحيوان وتبدأ خفض صعودا نحو قاعدة العنق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع بعناية على طول الجانبين الأيسر والأيمن من القفص الصدري والحرص على تجنب قطع أي الأوعية الدموية التي قد تنزف في التجويف الصدري. إزالة عظام الأضلاع عن طريق خفض إلى اليسار واليمين من خلال الحجاب الحاجز والعليا أجزاء من القفص الصدري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط فهم القصبة الهوائية من الماوس وسحب قدما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع القصبة الهوائية مع مقص تشريح وإزالة الرئتين من الفأرة. ملاحظة: قد تبقى قلب تعلق على الرئة. إذا حدث هذا، تشريح بعناية القلب بعيدا عن الرئتين والحرص على جمع كل خمسة فصوص (انظر الشكل 1 </stroنانوغرام&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بلطف مع PBS لإزالة الدم الزائد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقييم الإجمالي للأنسجة الرئة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخيار 1: في التصوير الجسم الحي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتصوير luciferase المراسل، ~ 10 دقيقة قبل التصوير، وإعطاء الحيوانات 150 ملغ / كغ جرعة من وسيفيرين التي داخل الصفاق (IP) حقن. الرئتين الصورة في الجسم الحي في الحيوانات تخدير أو عند إزالة بعد تشريح (الشكل 2) 5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخيار 2: التقييم الإجمالي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص الرئتين تحت المجهر ستيريو لتصور العقيدات الورم. ملاحظة: إذا الخلايا GFP المسمى، ومضان stereomicroscope قادرة تحتوي مكعب الضوء مع ماكسيما الإثارة / الانبعاثات المناسبة (مثل بالقرب 470/510 نانومتر) للكشف عن GFP يمكن أن تستخدم لفحص الرئتين تجسيمي لمضان قبل المعالجة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا الرئتين ليتم تحليلها على الفور، انتقل إلى قسم &quot;عزل الحمض النووي الريبي. خلاف ذلك، والمفاجئة تجميد الأنسجة باستخدام LIQUالنيتروجين معرف أو الثلج الجاف. تخزين في -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. عزل الحمض النووي الريبي ملاحظة: بالنسبة لتحليل تمثيلي، تم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام طقم عزل الحمض النووي الريبي (انظر قائمة المواد). في حين يستخدم التحليل الحالي المنتج مصنع واحد محدد، وتتوفر من عدة بائعين السمعة مجموعة متنوعة من مجموعات العزلة. بالإضافة إلى ذلك، غير طقم-أساليب الطرد المركزي مقرها هي أيضا خيار. [كدنا يجب إعداده من عينة السيطرة RNA إيجابية، مثل خط خلية أو البلازميد، لتحليل منحنى القياسية. بدلا من ذلك، يمكن شراء تحكم إيجابية محددة لتحقيق مجموعة التمهيدي (انظر قائمة المواد). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة استخدام الأنسجة المجمدة سابقا، وجمع الأنسجة المجمدة على الثلج الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس الأنسجة باستخدام إحدى الطرق التالية مثل: هاون ومدقة طحن يؤديها تسليم الثلج الجاف بعد تجميد الأنسجة في النيتروجين السائل. الخالط الأنسجة أو جهاز تفارق الميكانيكيةفي اقتراح الشركة المصنعة. صوتنة، أو الأسلوب المفضل الآخرين. ملاحظة: بالنسبة لتحليل تمثيلي، الأسلوب المفضل من التجانس هو صوتنة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل المعروضة في الشكل (3)، وإعداد العازلة تحلل (المنصوص عليها في RNA العزلة عدة) و 2 المركابتويثانول في نسبة 20 ميكرولتر 2-المركابتويثانول لكل 1 مل من تحلل العازلة. الأنسجة resuspend في 300 العازلة تحلل ميكرولتر تستكمل مع 2-المركابتويثانول لكل 30 غرام من الأنسجة ويصوتن لمدة 10 ثانية مع sonicator بنسبة 30٪ السعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة استخدام هاون ومدقة، الأنسجة الأرض resuspend في 300 ميكرولتر العازلة تحلل بعد الطحن. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر بروتين K إلى 590 ميكرولتر TE العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA). إضافة 600 ميكرولتر بروتين K الحل لكل 300 ميكرولتر (أي لكل 30 ملغ) من الأنسجة. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT. ملاحظة: قد تختلف وقت الهضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الطرد المركزي في ≥13000 ز لمدة 10 دقيقة لإزالة الحطام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف لأنابيب جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 450 ميكرولتر الإيثانول (96٪ -100٪) لكل 900 ميكرولتر من طاف لترسيب الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 700 ميكرولتر من مزيج المحللة / الإيثانول إلى العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الطرد المركزي في ≥13،000 ز لمدة 1 دقيقة لربط RNA إلى العمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل النفايات السائلة وبإضافة ما تبقى طاف إلى العمود وتدور مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم نسج جميع المحللة من خلال العمود، إضافة 350 ميكرولتر من غسل العازلة 1 إلى الجزء العلوي من العينات العمود وأجهزة الطرد المركزي في ≥13،000 ز لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل السائل من العمود واستبدال جزء العلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الدناز عن طريق خلط 5 وحدات من الدناز I انزيم مع 5 ميكرولتر من 10X الدناز و 40 ميكرولتر من الدناز / ريبونوكلياز المياه مجانا لكل عينة (الحجم الكلي لل50 ميكرولتر / عينة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من الدناز مزيج من كل عمود واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 350 ميكرولتر من غسل العازلة 1 إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي سامPLES في ≥13،000 ز لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل السائل من العمود واستبدال جزء العلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600 ميكرولتر من الاحتياطي اغسل 2 إلى العمود وتدور 30 ​​ثانية في ≥13،000 ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل السائل من العمود واستبدال جزء العلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر من غسل العازلة 2 وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في ≥13،000 ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع جزء من العمود في أنبوب المجموعة الجديدة وتجاهل أنبوب جمع القديم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50-100 ميكرولتر من ريبونوكلياز / الدناز المياه مجانا لعمود واحتضان لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور لمدة 1 دقيقة في ≥13،000 ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تشغيل شطافة التي تم جمعها من خلال عامود لزيادة الغلة RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للاستخدام الفوري، والحفاظ على عينات على الجليد، والشروع في الكميات. لاستخدامها في وقت لاحق، والمفاجئة تجميد الثلج الجاف أو النتروجين السائل. يخزن في الفريزر -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. </li></ol> 3. ستراند الأولى التجميعي ملاحظة: بالنسبة لتحليل تمثيلي، تم إجراء الناسخ العكسي (RT) رد فعل Fأوال ستراند [كدنا عدة التوليف مصممة لQRT-PCR (انظر قائمة المواد). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت العينات التي تم جمعها سابقا، ذوبان الجليد الأنابيب على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كمية الحمض النووي الريبي باستخدام معمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام 0،5-2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع، نفذ التوليف حبلا الأول باستخدام الناسخ العكسي لتوليد الأسهم كدنا]. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في العقيمة، وأنابيب ريبونوكلياز / الدناز خالية من PCR / لوحات، وإعداد مزيج التفاعل (الجدول 1). المزيج بلطف وأجهزة الطرد المركزي. برمجة جهاز PCR القياسية (الجدول 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع رد الفعل النهائي للحجم المطلوب (عادة 50-100 ميكرولتر) باستخدام معقم nuclease خالية من المياه. </li></ol> 4. في الوقت الحقيقي PCR ملاحظة: بالنسبة لتحليل تمثيلي، وكان يستخدم SYBR الأخضر. ومع ذلك، يمكن أن تكون بديلا أي الأسلوب المفضل في السلطة التقديرية للمستخدم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام [كدنا السيطرة إيجابي، وإنشاء منحنى القياسية لكل مجموعة التمهيدي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل أظهرت طن الشكل 3، وإعداد منحنى قياسي لHER2 البشري باستخدام الصانع الموصى [كدنا السيطرة الإيجابي (انظر قائمة المواد). فأرة الحاسوب GAPDH، استخدم سلبي كدنا] تحكم الرئة لتوليد منحنى القياسية. لكل التحقيق، وتمييع متسلسل [كدنا] 1: 4 لتوليد 5 المعايير. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من مجموع العينات، التي ينبغي أن تشمل منحنى القياسية والعينات التجريبية. ملاحظة: للحصول على تحليل ووصف هنا، حللت 2-3 مكررات لكل عينة تجريبية. تم إجراء تحليل المنحنى القياسي لتوليد نموذج الانحدار الخطي البسيط التي يمكن تطبيقها لتحديد القيمة النسبية للHER2 وGAPDH لكل عينة لحساب كمية تطبيع النهائية. وهذا التحليل أيضا ضمان كفاءة التمهيدي كافية للتحليل في متناول اليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في العقيمة، ريبونوكلياز / الدناز خالية من أنبوب، وإعداد مزيج الرئيسي (الجدول 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب سيد مزيج امونتي في العينة. تصعيد لعينة أكثر من واحد. استخدام مزيج الرئيسي لكل الجينات التجريبي للاهتمام، فضلا عن الرقابة الداخلية مثل GAPDH. استخدام التمهيدي لGAPDH بتركيز نهائي من 200 نانومتر. ملاحظة: الرقابة الداخلية هي مفيدة بشكل خاص عند محاولة التمييز بين الأصل خلية الإنسان والفأر. ملاحظة: تم تحسين تركيز التمهيدي لHER2 وتحديدها من قبل الشركة المصنعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة اختبار تحتوي على 1 cDNAs ميكرولتر المقابلة لكل عينة القياسية أو التجريبية. تخصيص 1 على الأقل كدنا] عينة / جيد لكل التحقيق التمهيدي. إضافة 19 ميكرولتر من مزيج الرئيسي لكل بئر لكل التحقيق التمهيدي. ملاحظة: للحصول على بيانات تمثيلية في الشكل (3)، وقد تم تحليل عينات كدنا] في نسختين لكل التحقيق التمهيدي ورسوم بيانية كمتوسط ​​العينتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رد فعل تشغيل في جهاز QRT-PCR باستخدام أوصى أو اختبارها سابقا بروتوكول PCR. انظر الجدول 4 </sترونج&gt; لبروتوكول PCR المستخدمة للبيانات ممثل في الشكل 3 والشكل 4. </li></ol>

<ol><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li>
<li>Bos, P. D., Nguyen, D. X., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Modeling metastasis in the mouse.</a> Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 571-577 (2010).</li>
<li>Kim, I. S., Baek, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Mouse models for breast cancer metastasis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 394 (3), 443-447 (2010).</li>
<li>Saxena, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebuilding+cancer+metastasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Rebuilding cancer metastasis in the mouse.</a> Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).</li>
<li>Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for tumor metastasis.</a> Methods Mol Biol. 928, 221-228 (2012).</li>
<li>Rampetsreiter, P., Casanova, E., Eferl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+mouse+models+of+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Genetically modified mouse models of cancer invasion and metastasis.</a> Drug Discov Today Dis Models. 8 (2-3), 67-74 (2011).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17 (5), 545-580 (2003).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 103-115 (2008).</li>
<li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+bioluminescence+imaging+of+mouse+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2015 (1), (2015).</li>
<li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochem Biophys Res Commun. 313 (4), 856-862 (2004).</li>
</ol>

لا يعملون ESY وMAA التي كتبها FirstString البحوث وشركة لا يحملون أي مصلحة مالية في الشركة. قدمت FirstString أبحاث شركة البيانات التصوير luciferase المراسل الذي قدم في هذه المخطوطة. GSG هو الرئيس والرئيس التنفيذي لشركة أبحاث FirstString. CLG هو موظف للبحوث FirstString. GSG وCLG ديك خيارات الأسهم الصادرة عن أبحاث FirstString.

يصف هذا البروتوكول استخدام QRT-PCR لتقييم الثديية ورم خبيث الخلايا السرطانية إلى الرئة باستخدام نموذج طعم أجنبي الماوس. ومن المسلم به أن التقنيات الأخرى، بما في ذلك التصوير إضاءة الحيوية، متاحة وفعالة للكشف عن ورم خبيث الرغم من وجود قيمهم والقيود أيضا. البيانات المقدمة توحي بأن QRT-PCR يوفر تدبيرا فعالا لكشف مرنا المستمدة من ورم داخل أنسجة الرئة لتحديد الكميات من إجمالي ورم خبيث. يقترح هذا التحليل QRT-PCR يوفر طريقة الثانوي التي يمكن أن تكمل أو أن يقوم بدلا من هذه التقنيات التصوير...

ويقترح تحليل QRT-PCR كوسيلة لتقييم الورم ورم خبيث. ويقترح هذا الأسلوب كبديل للمستخدمين الذين يرغبون في تقييم ورم خبيث ولكن قد لا يكون الحصول على معدات معينة مثل في الجسم الحي معدات التصوير أو مضان المجسام قادرة. وتقدم يتبع مناقشة الأساليب المستخدمة عادة من قبل مظاهرة لكيف يمكن استخدام تحليل QRT-PCR إما منفصلة أو كوسيلة مصاحب لتقييم ورم خبيث. هذا الإجراء لديه القدرة على تقديم تحليل كمي لعبء النقيلي. الطرق المعيارية لتحليل الإجمالي، بما في ذلك التصور من الرئتين تحت stereomicroscope وكذلك باجتزاء المسلسل تليها الهيماتوكسيلين ويوزين (H &amp; E) تلطيخ من أنسجة الرئة، وقابلة للقياس الكمي ولكن تعتمد بشكل كبير على المستخدم تعريف المعلمات لحساب 2-5. عند تقييم الرئتين بأكملها باستخدام stereomicroscope، الانبثاث السطح الكبيرة فقط هي VISIبليه ويتطلب تحليل المحقق أن لديهم معرفة معقولة من الرئة التركيب التشريحي لتحديد ما يشكل آفة المتنقل. وضع العلامات الفلورية من الخلايا السرطانية مع علامة مثل GFP واستخدام stereomicroscope الذي يحتوي مكعب الضوء مع ماكسيما المناسب الإثارة / الانبعاثات (على سبيل المثال قرب 470/510 نانومتر لGFP) يساعد في هذه العملية، ولكن فقط العقيدات الورم سطح قابلة للكشف . بالإضافة إلى ذلك، مضان من تلوث الدم، وهو أمر واضح تحت نفس المعلمات كما GFP، قد يؤدي إلى هوية مزورة من الآفات النقيلي المحتملة. باجتزاء في الرئة تليها H &amp; E تلطيخ لتصور الانبثاث الرئة هو طريقة مفيدة لتقييم micrometastases والعمليات المجهرية الأخرى بما في ذلك تسلل الخلايا المناعية ولكن غالبا ما يتطلب استخدام أنسجة الرئة بالكامل لتضمين البارافين، باجتزاء، والإجراءات تلطيخ. ولذلك، الإجراءات النهائية ليست مثالية تتبع هذا methoد. على الرغم من أن قياس الكمي، هذا الإجراء يتطلب المحقق لتقييم عدد كبير من أقسام الرئة الملون لكل حيوان للتأكد من أن التحليل يمثل هيكل 3D كامل من الرئة. ونتيجة لذلك، وهذا النوع من الفحص هو مضيعة للوقت، يمكن أن يؤدي إلى احتساب الخطأ، وتحليل يعتمد بشكل كبير على محقق تقدير. العديد من تقنيات التصوير في الجسم الحي (مثل التصوير بالرنين المغناطيسي، PET، SPECT) وتستخدم حاليا لإجراء اختبار أو العمليات البيولوجية في نماذج القوارض التجريبية 8. في الجسم الحي التصوير إضاءة الحيوية هو أسلوب شائع استخدامها للحصول على رأي الإجمالي من ورم خبيث 9. يتم تطبيق هذه التقنية بشكل عام لتقييم وجود نشاط luciferase المراسل بسبب تراكم الخلايا السرطانية، والتي صممت لاحتواء عنصر استجابة luciferase المراسل، الموجودة في أجهزة معينة مثل الغدة الثديية بعد زرع الخلايا السرطانية والرئة على الانبثاث عفوية 1وبفعل 0 التصور النشاط luciferase المراسل عن وجود الركيزة وسيفيرين (D-وسيفيرين). luciferase المراسل يحفز نزع الكربوكسيل التأكسدي من D-وسيفيرين إلى oxyluciferin توليد تلألؤ بيولوجي. في حين بالمعلومات، وهذه الطريقة محدودة بسبب العديد من العوامل بما في ذلك استقرار الركيزة (أي قصيرة العمر النصفي)، التوزيع المناسب للالركيزة التي تعتمد على كيفية تسليمها إلى حيوانات التجارب، وانخفاض الحساسية للكشف عن 9. A الفضل الاساسي لهذه التقنية هي أنها غير الغازية، لا يمكن أن يؤديها على الحيوانات الحية، ويمكن أن يؤدي إلى الكشف عن النقائل الخلايا السرطانية في الأجهزة المتعددة التي ربما لم تحصد عادة في تشريح 9،10. وأحد الجوانب الإيجابية للفي الجسم الحي تقنيات التصوير هو أن أنسجة الرئة ودون أن يمسها السماح للإجراءات الثانوية مثل البارافين التضمين أو المعروضة هنا، تحليل QRT-PCR. ومع ذلك، لأن QRT-PCR هو theoreticaLLY مقياسا أكثر حساسية من الكشف والتقييم الإجمالي قد لا تكشف عن انخفاض أعداد الخلايا السرطانية موجودة في الرئة. وإن كان مفيدا، وتقنيات التصوير المذكورة أعلاه يمكن أن تكون بديلا أو تستكمل مع أسلوب QRT-PCR توصف حاليا. QRT-PCR لديه القدرة على توفير قدر حساسية مرنا المستمدة من ورم داخل الرئة.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>GeneJet RNA Isolation</td><td>Kit Thermo Scientific</td><td>K0732</td><td></td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix ل QRT-PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix &nbsp ؛</td><td>بيو راد</td><td>172-5121&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>اختبار PrimePCR SYBR الأخضر: ERBB2 ، Human &nbsp ؛</td><td>بيو راد</td><td>100-25636&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>قالب PrimePCR لمقايسة SYBR الخضراء: ERBB2 ، Human &nbsp ؛</td><td>بيو راد</td><td>100-25716&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>تسلسل التمهيدي</td><td></td><td></td> gapdh <td>ل-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG</td></tr></tbody></table>

تقييم الرئة الانبثاث في ماوس الثديية ورم المجموعات بواسطة الكمي في الوقت الحقيقي pcr

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

المرض المنتشر هو انتشار الخلايا السرطانية الخبيثة من موقع السرطان الأساسي لجهاز بعيد وهو السبب الرئيسي لسرطان الوفيات المرتبطة 1. وتشمل المواقع المشتركة للانتشار النقيلي الرئة، العقدة الليمفاوية والمخ، والعظام 2. الآليات التي تدفع الانبثاث هي مناطق مكثفة لأبحاث السرطان. ونتيجة لذلك، المقايسات فعالة لقياس العبء المنتشر في مواقع بعيدة الانبثاث هي مفيدة لأبحاث السرطان. تقييم الانبثاث الرئة في نماذج ورم الثدي تتم عادة عن طريق الملاحظة النوعية الإجمالية للأنسجة الرئة بعد تشريح. الأساليب الكمية لتقييم ورم خبيث تقتصر حاليا لخارج الحي وتقنيات التصوير مقرها الجسم الحي والتي تتطلب المعلمات التي يحددها المستخدم. العديد من هذه التقنيات هي في مستوى الحي كله وليس على المستوى الخلوي 3-6. على الرغم من أن وسائل التصوير الجديدة استخدام متعدد الفوتون المجهر قادرة على تقييم metastasis على المستوى الخلوي 7، هذه الإجراءات أنيقة للغاية هي أكثر ملاءمة لتقييم آليات نشر بدلا من التقييم الكمي للعبء النقيلي. هنا، يتم تقديم طريقة بسيطة في المختبر لتقييم كمي لورم خبيث. باستخدام كمية الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR)، ويمكن الكشف عن مرنا الخلايا السرطانية معين داخل أنسجة الرئة الماوس.

ما وراء الوقت المستغرق لأداء التلقيح الأولي من الخلايا السرطانية في حيوانات التجارب وإذا المنفذ، والابتدائي في تحليل الورم الجسم الحي، وحصاد الأنسجة والعزلة RNA، وتحليل QRT-PCR هو إجراء 1-2 يوم (الشكل 1) . مثال على التحليل الإجمالي هو التصوير إضاءة الحيوية لتقييم الخلايا السرطانية داخل أنسجة الرئة. هنا، تم إجراء ا...

يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR) للكشف عن مرنا محددة الخلايا السرطانية تمثل ورم خبيث في الأنسجة الماوس الرئة.

تقييم الرئة الانبثاث في ماوس الثديية ورم المجموعات بواسطة الكمي في الوقت الحقيقي PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن كمية MRNA محددة من الخلايا الورمية في الرئة، كطريقة لتحليل النقائل السرطانية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها مقياساً كمياً للنقائل. ولإجراء تشريح لورم الرئة، بعد القتل الرحيم للفأر باستخدام جرعة مميتة من isofluorine وفقاً للبروتوكول النصي، ضع الفأر على لوح رغوي على ظهره مع بسط أطرافه، واستخدم دبابيس التشريح لتثبيته باللوح.بعد رش الفأر بالإيثانول، استخدم الملقط للإمساك بالجزء السفلي من الحيوان من المنتصف، وباستخدام المقص، قص للأعلى باتجاه الرقبة عبر الجلد، مع الحرص على عدم ثقب التجويف البريتوني للفأر. الآن، أمسك البريتون عند الطرف السفلي للحيوان، وابدأ القص للأعلى باتجاه قاعدة الرقبة. قص بعناية على طول الجانبين الأيسر والأيمن للقفص الصدري، مع مراعاة عدم قطع أي أوعية دموية قد تنزف في التجويف الصدري.أزل عظام الضلوع عن طريق القص من الجهتين اليسرى واليمنى، عبر الحجاب الحاجز والأجزاء العلوية من القفص الصدري. ثم، وباستخدام الملقط، أمسك بالرغامي للفأر واسحبه للأمام، واستخدم مقص التشريح لقطع الرغامي قبل إزالة الرئتين من الفأر. استخدم PBS لغسل أنسجة الرئة بلطف.بعد ذلك، وبعد التقييم العياني لأنسجة الرئة وفقاً للبروتوكول المكتوب، إذا كان من المقرر تحليل الرئتين على الفور، فابدأ بعملية عزل RNA. لعزل RNA من الأنسجة، ابدأ بتجانس الأنسجة باستخدام إحدى الطرق المدرجة في البروتوكول المكتوب. قم بتحضير محلول التحلل (lysis buffer) من طقم عزل RNA، وأضف 20 µL من التوركابتوإيثانول (tumor captoethanol) إلى كل 1 mL من محلول التحلل.أعد تعليق كل 30 grams من الأنسجة في 300 µL من محلول التحلل (lysis buffer)، وقم بمعالجة الأنسجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 ثوانٍ باستخدام جهاز سونيكاتور مضبوط على سعة 30%. أضف 10 µL من البروتيناز K (protinase K) إلى 590 µL من محلول TE المنظم، ثم أضف 600 µL من هذا المحلول إلى 300 µL من الأنسجة التي تمت معالجتها بالموجات فوق الصوتية. تُحضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.بعد ذلك، قم بطرد العينات مركزياً عند 13,000 ×g أو أكثر لمدة 10 دقائق لإزالة الحطام. ثم انقل السائل الطافي إلى أنابيب جديدة. أضف 450 µL من الإيثانول لكل 900 µL من السائل الطافي لترسيب الـ RNA.ثم انقل 700 µL من مزيج الإيثانول والليزات إلى عمود RNA. قم بالطرد المركزي مرة أخرى بسرعة ≥ 13,000 ×g لمدة دقيقة واحدة لربط الـ RNA بالعمود. بعد ذلك، تخلص من السائل الفضلات، وأضف المادة الطافية المتبقية إلى العمود، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى.بعد ذلك، أضف 350 µL من محلول الغسيل (wash buffer one) إلى الجزء العلوي من العمود، ثم قم بطرد مركزي للعينات لمدة 30 ثانية. تخلص من السوائل العادمة وأعد العمود إلى الأنبوب. قم بتحضير إنزيم DNase عن طريق خلط 5 units من إنزيم DNase one مع 5 µL من محلول DNase buffer بتركيز 10X، و40 µL من ماء DNase RNase free لكل عينة.أضف 50 µL من مزيج DNase إلى كل عمود، وحضّنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، أضف 350 µL من محلول الغسيل الأول (wash buffer one) إلى الأعمدة وقم بطرد العينات مركزياً لمدة 30 ثانية. وبعد التخلص من المحلول العادم، أضف 600 µL من محلول الغسيل الثاني (wash buffer two)، وقم بالتدوير المركزي لمدة 30 ثانية إضافية.تخلص من السائل قبل إضافة 250 microliters من محلول الغسيل الثاني (wash buffer two)، ثم قم بالتدوير لمدتين دقيقتين. انقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد، وأضف من 50 إلى 100 microliters من الماء الخالي من RNase وDNase إلى العمود. بعد التحضين لمدة دقيقة واحدة، قم بالتدوير لمدة دقيقة واحدة.أعد تمرير المادة المستخلصة المجمعة عبر العمود لزيادة حصيلة الـ RNA. وللاستخدام الفوري، احتفظ بالعينات على الثلج. أما للاستخدام اللاحق، فقم بالتجميد السريع باستخدام الثلج الجاف أو النيتروجين السائل، وخزنها عند درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى وقت الحاجة إليها.باستخدام مقياس الطيف الضوئي، قم بتحديد كمية الـ RNA. بعد ذلك، في أنابيب أو ألواح PCR معقمة وخالية من RNase و DNase، استخدم من 0.5 إلى 2 ميكروغرام من الـ RNA الكلي لتحضير خليط تفاعل عملية النسخ الأولى (transynthesis)، كما هو موضح في هذا الجدول. اخلط المكونات، ثم قم بالطرد المركزي اللطيف، وبرمج جهاز PCR قياسي باستخدام البرنامج الموضح هنا.عند اكتمال التفاعل، استخدم ماءً معقماً وخالياً من النوكلياز لتخفيف التفاعل النهائي إلى الحجم المطلوب. ولإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real time PCR)، استخدم DNA مكمل (cDNA) كعنصر تحكم إيجابي، مثل HER2 البشري، لإنشاء منحنى قياسي لكل مجموعة من البادئات عن طريق تحضير تخفيفات تسلسلية من واحد إلى أربعة من الـ cDNA لتوليد خمسة معايير. بعد ذلك، احسب العدد الإجمالي للعينات، والتي يجب أن تشمل منحنى القياس والعينات التجريبية.بعد ذلك، وفي أنابيب معقمة وخالية من RNase و DNase، قم بتحضير مزيج رئيسي (master mix) لكل جين تجريبي مستهدف، بالإضافة إلى ضابط داخلي، مثل gapdh. قم بتحضير لوحة اختبار تحتوي على 1 µL من C DNase لكل عينة قياسية أو تجريبية. خصص عينة C DNA واحدة على الأقل لكل بئر، لكل مسبار بادئ (primer probe).أضف 19 µL من المزيج الرئيسي (mastermix) في كل بئر، لكل مسبار بادئ. تُظهر تجربة التألق الحيوي هذه أن رئتي الفأر المعالجتين بـ ACT1، والذي يستهدف بروتين الوصلة الفجوية Connexin 43، تظهران نتيجة سلبية لنشاط اللوسيفيراز، مما يشير إلى غياب الخلايا الورمية في النسيج. ومع ذلك، فإن تحليل مقاطع H&E لنسيج الرئة يُظهر وجود نقائل دقيقة لم يتم إضاءتها بواسطة اللوسيفيراز، مما يشير إلى أن تصوير اللوسيفيراز ليس حساساً بما يكفي للكشف عن الأعداد القليلة من الخلايا الورمية.تظهر هنا نتائج تجربة qRT-PCR، باستخدام مسبار متخصص لـ HER2، للكشف عن خلايا ورم JIMT1 البشرية الموجبة لـ HER2 في أنسجة الرئة من خلايا زُرعت في الأصل في الوسادة الدهنية للذاكرة لدى الفأر. على الرغم من عدم ملاحظة أي نقائل مرئية عيانياً في أي من الرئات، إلا أن qRT-PCR كشف عن وجود نقائل في عينتين من أصل 11 عينة. في هذا الشكل، تم إعداد تحليل منحنى قياسي لتحديد مستويات HER2 النسبية الموحدة وفقاً لـ gapdh في رئة الفأر في سلسلة من أعداد الخلايا.تشير النتائج إلى أن تقنية qRT-PCR، باستخدام مسبار HER2، كانت حساسة بما يكفي للكشف عن مستويات HER2 في عدد قليل يصل إلى 10 خلايا. وأخيراً، يوضح تحليل الانحدار هذا عدد الخلايا النسبي في كل عينة من الرئة، بما في ذلك الضوابط الموجبة والسالبة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ست إلى ثماني ساعات، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر اتخاذ الاحتياطات اللازمة للحفاظ على سلامة الـ RNA خلال عملية عزل الـ RNA وتفاعل النسخ العكسي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الكشف عن النقائل في أنسجة الرئة الكاملة، باستخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (quantitative real time PCR).

evaluation-lung-metastasis-mouse-mammary-tumor-models-quantitative

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

هذا النموذج مثلي من سرطان البروستاتا البشرية يسمح للالكمي لحجم الورم، وتعميم الخلايا السرطانية، وتشكيل ورم خبيث متميزة إلى الرئة. كما يجب أن الهروب خلايا الجهاز الرئيسي، تدخل مجرى الدم، وزرع في موقع ثانوي، وهذا النموذج يلخص بشكل فعال السيناريو في البشر.

على الفئران نموذج مثلي من سرطان البروستاتا البشرية الانبثاث

الهدف من هذا البروتوكول هو دراسة تكوين أورام الثدي. باستخدام هذه التقنية ، تتم إزالة أورام الثدي في الفئران وتحضير الخلايا الأولية من الأورام. يتم تضمين بروتوكول استخراج الرئة لدراسة ورم خبيث في الرئة. علاوة على ذلك ، يتم تضمين بروتوكول آخر لتحليل الخلايا الليفية الجنينية للفأر من جنين الفأر.

ورم الابتدائي وMEF عزل الخلايا لدراسة الرئة الانبثاث

هنا نصف النموذج والنهج لدراسة وظائف البلاعم السنخية الرئوية في ورم خبيث سرطاني. لإثبات دور هذه الخلايا في ورم خبيث ، تم استخدام النموذج المتزاوي (4T1) لسرطان الثدي بالتزامن مع استنفاد البلاعم السنخية مع الجسيمات الشحمية كلودرونات...

دراسة دور السنخية الضامة في سرطان الثدي ورم خبيث

نماذج ما قبل السريرية تقييم العلاج المساعد استهداف ورم خبيث سرطان الثدي تفتقر. لمعالجة هذا، قمنا بتطوير نموذج الفئران من دي نوفو الرئوي الانبثاث غدي الثديية، حيث العلاجات التي تدار في وضع مساعد (بعد استئصال الجراحي للأورام الأولية) يمكن تقييمها لفعالية في التأثير الانبثاث الرئوي المصنف سابقا.

الإجراءات الجراحية ومنهجية لنموذج الفئران قبل السريرية دي نوفو سرطان الثديي الانبثاث

والهدف من هذه المادة تقديم وصف مفصل للبروتوكول للمقايسة خبيث الرئوية (PuMA). هذا النموذج يسمح للباحثين لدراسة نمو الخلايا osteosarcoma المنتشر (OS) في أنسجة الرئة باستخدام ويديفيلد fluorescence أو مجهر مسح ليزر [كنفوكل].

الاعتبارات العملية في دراسة الاستعمار الرئة المنتشر في أوستيوساركوما باستخدام مقايسة خبيث الرئوية

نحن نقدم استئصال الثدي الجذري ونموذج سرطان الثدي مورين أورثوتوبيك مع تقنية الإضاءة الحيوية لتقدير عبء الورم لمحاكاة تطور سرطان الثدي البشرية.

توليد نموذج سرطان الثدي المنتشر مورين أورثوتوبيك والقيام باستئصال الثدي الجذري مورين

هذا العمل المسبقة بروتوكول متقدم لتقييم دقيق تحميل الورم عن طريق الكشف عن البروتين الفلوري الأخضر وإشارات الإضاءة الحيوية، فضلا عن التكامل بين تقنية الكشف الجزيئي الكمي.

دراسة ثلاثية سلبية سرطان الثدي باستخدام نموذج سرطان الثدي Orthotopic

النهج الموصوف يجمع بين اختبارات الانبثاث الوريد الذيل التجريبية مع في الجسم الحية التصوير الحيواني للسماح الرصد في الوقت الحقيقي لتكوين ورم خبيث سرطان الثدي والنمو بالاضافه إلى التحديد الكمي للعدد الانبثاث وحجم في الرئتين.

الجمع بين استخدام الذيل الوريد الانبثاث الاختبارات والوقت الحقيقي في التصوير فيفو لقياس سرطان الثدي الاستعمار المنتشر والعبء في الرئتين

غالبا ما يستخدم الحقن الوريدي للخلايا السرطانية في أبحاث الانبثاث ، ولكن عبء الورم النقيلي قد يكون من الصعب تحليله. هنا، ونحن نظهر نموذج حقن ذيل الوريد من الانبثاث وتشمل نهجا جديدا لتحليل عبء ورم الرئة النقيلي الناتجة.

التحليل المرضي لنقائل الرئة بعد الحقن الجانبي الوريد الذيل من الخلايا السرطانية

نحن نصف طريقة أكثر اتساقا وسرعة لتحديد الانبثاث الرئوي في نموذج سرطان الثدي 4T1 باستخدام فيجي-ImageJ.

استخدام تحليل الصور القائم على الكمبيوتر لتحسين القياس الكمي لنقائل الرئة في نموذج سرطان الثدي 4T1

تصف المخطوطة منهجية لإنشاء ومراقبة النمو الطولي للورم الخبيث الرئوي التلقائي من أورام الثدي المحقونة تقويم العظام ، والتي يمكن التدخل في جميع مراحل الشلال النقيلي.

في الجسم الحي تصوير لقياس ورم خبيث في الرئة التلقائي لخلايا ورم الثدي المحقونة تقويم العظام

اكتشف كيفية تقييم الانبثاث الرئوي في الفئران باستخدام تقنية PCR الكمي في الوقت الحقيقي. تتيح هذه الطريقة الكشف الحساس عن الحمض النووي الريبي الخاص بالأورام وتحديد مستوى الانتشار السرطاني بدقة عالية.

تقييم الرئة الانبثاث في ماوس الثديية ورم المجموعات بواسطة الكمي في الوقت الحقيقي PCR

استكشف المزيد من الفيديوهات