تقييم الرئة الانبثاث في ماوس الثديية ورم المجموعات بواسطة الكمي في الوقت الحقيقي PCR

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن كمية MRNA معين من الخلايا السرطانية في الرئة ، كطريقة لتحليل ورم خبيث. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها مقياس كمي للورم الخبيث. لإجراء تشريح ورم الرئة ، بعد القتل الرحيم للفأر باستخدام جرعة قاتلة من الأيزفلور وفقا لبروتوكول النص ، ضع الماوس على لوح رغوي على ظهره مع انتشار الأطراف ، واستخدم دبابيس التشريح لتثبيته على السبورة.

بعد استخدام الإيثانول لرش الماوس ، استخدم الملقط لاستيعاب الجزء السفلي من في المنتصف ، وباستخدام المقص ، قم بقص لأعلى باتجاه الرقبة من خلال الجلد ، مع الحرص على عدم اختراق التجويف البريتوني للفأر. الآن ، أمسك الصفاق في الطرف السفلي من ، وابدأ في القطع لأعلى باتجاه قاعدة الرقبة. قم بقص الجانبين الأيسر والأيمن من القفص الصدري بعناية ، مع الحرص على عدم قطع أي أوعية دموية قد تنزف في التجويف الصدري.

قم بإزالة عظام الأضلاع عن طريق القطع إلى اليسار واليمين ، من خلال الحجاب الحاجز والأجزاء العلوية من القفص الصدري. ثم ، باستخدام الملقط ، أمسك القصبة الهوائية للفأر واسحب للأمام ، واستخدم مقص التشريح لقطع القصبة الهوائية قبل إزالة الرئتين من الفأر. استخدم PBS لغسل أنسجة الرئة برفق.

بعد ذلك ، بعد التقييم الإجمالي لأنسجة الرئة وفقا لبروتوكول النص ، إذا كان سيتم تحليل الرئتين على الفور ، فانتقل إلى عزل الحمض النووي الريبي. لعزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة ، ابدأ بتجانس الأنسجة باستخدام إحدى الطرق المدرجة في بروتوكول النص. قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل من مجموعة عزل الحمض النووي الريبي ، وأضف 20 ميكرولترا من كابتوإيثانول الورم إلى كل مليلتر من محلول التحلل.

أعد تعليق كل 30 جراما من الأنسجة في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل ، ومع ضبط الصوتنة على سعة 30٪ ، قم بصوتنة الأنسجة لمدة 10 ثوان. أضف 10 ميكرولتر من البروتيناز K إلى 590 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE ، وأضف 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت إلى 300 ميكرولتر من الأنسجة المصوتة. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات بأكبر من أو يساوي 13 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق لإزالة الحطام. ثم انقل المادة الطافية إلى أنابيب جديدة. أضف 450 ميكرولترا من الإيثانول إلى كل 900 ميكرولتر من المادة الطافية لترسيب الحمض النووي الريبي.

ثم انقل 700 ميكرولتر من مزيج الإيثانول المحلل إلى عمود الحمض النووي الريبي. قم بالدوران مرة أخرى أكبر من أو يساوي 13 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة لربط الحمض النووي الريبي بالعمود. ثم تخلص من النفايات السائلة ، وأضف المادة الطافية المتبقية إلى العمود ، ثم قم بالتدوير مرة أخرى.

بعد ذلك ، أضف 350 ميكرولترا من المخزن المؤقت للغسيل إلى الجزء العلوي من العمود ، وقم بالطرد المركزي للعينات لمدة 30 ثانية. تخلص من النفايات السائلة واستبدل العمود الموجود في الأنبوب. قم بإعداد DNase عن طريق خلط خمس وحدات من إنزيم DNase واحد مع خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت 10X DNase ، و 40 ميكرولترا من الماء الخالي من DNase RNase لكل عينة.

أضف 50 ميكرولترا من مزيج DNase إلى كل عمود ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم أضف 350 ميكرولترا من مخزن الغسيل إلى الأعمدة وقم بالطرد المركزي للعينات لمدة 30 ثانية. بعد التخلص من محلول النفايات ، أضف 600 ميكرولتر من مخزن الغسيل الثاني ، وقم بتدويرها لمدة 30 ثانية إضافية.

تخلص من السائل قبل إضافة 250 ميكرولتر من مخزن الغسيل الثاني ، ثم قم بتدويره لمدة دقيقتين. انقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد ، وأضف 50 إلى 100 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase DNase إلى العمود. بعد الحضانة لمدة دقيقة واحدة ، قم بالدوران لمدة دقيقة واحدة.

أعد تشغيل المصطاة المجمعة عبر العمود لزيادة إنتاجية الحمض النووي الريبي. للاستخدام الفوري ، احتفظ بالعينات على الثلج. للاستخدام لاحقا ، قم بالتجميد على الثلج الجاف أو النيتروجين السائل ، وتخزينه في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لحين الحاجة.

باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، حدد كمية الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، في أنابيب أو ألواح تفاعل البوليميراز المتسلسل المعقمة الخالية من RNase DNase ، استخدم 0.5 إلى 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لتحضير مزيج التفاعل للتخليق الأول ، كما هو موضح في هذا الجدول. امزج جهاز الطرد المركزي برفق وقم ببرمجة جهاز PCR قياسي باستخدام البرنامج الموضح هنا.

عند اكتمال التفاعل ، استخدم الماء المعقم الخالي من النوكلياز لتخفيف التفاعل النهائي إلى الحجم المطلوب. لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، استخدم الحمض النووي C للتحكم الإيجابي ، مثل HER2 البشري ، لإعداد منحنى قياسي لكل مجموعة أولية عن طريق إعداد واحد إلى أربعة تخفيفات تسلسلية من الحمض النووي C لتوليد خمسة معايير. بعد ذلك ، احسب عدد العينات الإجمالية ، والتي يجب أن تشمل المنحنى القياسي والعينات التجريبية.

بعد ذلك ، في الأنابيب الخالية من RNase DNase المعقمة ، قم بإعداد مزيج رئيسي لكل جين تجريبي ذي أهمية ، بالإضافة إلى عنصر تحكم داخلي ، مثل gapdh. قم بإعداد لوحة اختبار تحتوي على ميكرولتر واحد من C DNase لكل عينة قياسية أو تجريبية. خصص عينة واحدة على الأقل من الحمض النووي C لكل بئر ، لكل مسبار أولي.

أضف 19 ميكرولترا من الماستر ميكس لكل بئر لكل مسبار أولي. توضح تجربة التلألؤ البيولوجي هذه أن رئتي الفئران المعالجة ب ACT1 ، والتي تستهدف بروتين تقاطع الفجوة Connexin 43 ، تبدو سلبية لنشاط لوسيفيراز ، مما يشير إلى عدم وجود خلايا سرطانية في الأنسجة. ومع ذلك ، فإن تحليل أقسام H & E من أنسجة الرئة يظهر نقائل دقيقة لم يتم إضاءتها بواسطة لوسيفيراز ، مما يشير إلى أن تصوير لوسيفيراز ليس حساسا بما يكفي للكشف عن أعداد منخفضة من الخلايا السرطانية.

فيما يلي نتائج تجربة qRT-PCR ، باستخدام مسبار خاص ب HER2 ، للكشف عن الخلايا السرطانية البشرية HER2 بالإضافة إلى JIMT1 في أنسجة الرئة من الخلايا المزروعة في الأصل في وسادة دهون ذاكرة الفأر. على الرغم من عدم ملاحظة نقائل مرئية بشكل كبير على أي من الرئتين ، إلا أنه في عينتين من عينتين من 11 عينة ، اكتشف qRT-PCR نقائل. في هذا الشكل ، تم إعداد تحليل منحنى قياسي لتحديد مستويات HER2 النسبية التي تم تطبيعها لفجوة رئة الفأر في سلسلة أرقام الخلايا.

تشير النتائج إلى أن qRT-PCR ، باستخدام مسبار HER2 ، كان حساسا بدرجة كافية للكشف عن مستويات HER2 في ما لا يقل عن 10 خلايا. أخيرا ، يظهر تحليل الانحدار هذا العدد النسبي للخلايا في كل عينة رئة ، بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ست إلى ثماني ساعات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام الاحتياطات اللازمة للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي أثناء عزل الحمض النووي الريبي وتفاعل النسخ العكسي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف ورم خبيث في أنسجة الرئة بأكملها ، عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي.