مضان وتلألؤ بيولوجي التصوير من التحت خلوية كا ²⁺ في المسنين الحصين الخلايا العصبية

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في إعادة تشكيل الكالسيوم في الدماغ المتقدم في السن باستخدام التصوير الفلوري والتلألؤ البيولوجي للكالسيوم العصاري الخلوي والميتوكوندريا في الثقافات طويلة المدى للخلايا العصبية الحصين ، والتي تعتبر نموذجا للشيخوخة العصبية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فهم الأسئلة الرئيسية في مجال الشيخوخة ، مثل كيف تساهم إعادة تشكيل الكالسيوم داخل الخلايا في السمية المثيرة وتلف الخلايا العصبية ، وكلاهما يتعلق بالحمل الزائد للكالسيوم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه من الممكن متابعة إعادة تشكيل الكالسيوم عن كثب في الخلايا العصبية الفردية باستخدام الثقافات في DYS مختلفة في المختبر من نفس ازدواجية العينة لهذه التقنية من خلال أو علاج السكتة الدماغية أو مرض الخلية لأنها متغيرة هدف جديد يتعلق بالحمل الزائد للكالسيوم في الأمراض المرتبطة بهذا العامل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، أصبح لدى يسوع فهم جيد لكيفية إجراء التصوير الفلوري والذكريات للكالسيوم العصاري الخلوي والكالسيوم في الثقافات قصيرة وطويلة المدى للخلايا العصبية في الحصين في الفئران. لبدء هذا الإجراء ، قم بتوزيع زلات الغطاء على شريط من الطفيلي في طبق بتري. ثم ضع 200 ميكرولتر من بولي دي ليسين بمعدل ملليغرام واحد لكل مليلتر على كل زلة غطاء وعالجها طوال الليل.

في اليوم التالي ، اغسل زلات الغطاء بالماء المقطر المزدوج والمعقم كل 15 دقيقة لمدة 90 دقيقة في ظروف معقمة. ضع زلات الغطاء في المتعدد واحتفظ بها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى الاستخدام. لعزل الخلايا العصبية في الحصين ، افتح جمجمة صغار الفئران حديثي الولادة بمقص معقم ، واستخرج الدماغ بملعقة واغسله بسرعة في وسط F 12 لحم الخنزير.

ثم قم بعمل قطع قطري باستخدام المشرط في كل نصف كرة كرة ونقله إلى طبق بتري الذي يحتوي على وسط لحم الخنزير F 12 تحت المجهر. تخلص من السحايا. حدد الحصين بعناية في موقع مقعر مميز فوق القشرة.

ثم افصل الحصين عن القشرة عن طريق سحبها بعيدا بعناية وإزالتها باستخدام مقص العين. بعد ذلك ، انقل قطع الحصين إلى قارورة تحتوي على 1.8 مل من محلول البيبان المصفى مسبقا. احتضنها عند 37 درجة مئوية مع رج لطيف من حين لآخر لمدة 15 دقيقة.

ثم أضف 90 ميكرولترا من محلول الحمض النووي الواحد. أضف 50 ميكروغراما لكل مليلتر واحتضنها لمدة 15 دقيقة أخرى. بعد ذلك ، انقل الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 10 ملليلتر واغسل الشظايا بوسط ثقافة عصبية قاعدية جديدة.

احصل على تعليق خلوي عن طريق تمرير شظايا الأنسجة عبر ماصة بلاستيكية سعة خمسة ملليلتر. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 160 جم لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة السوبينات باستخدام ماصة مراعي بلاستيكية معقمة الحبيبات بعناية في مليلتر واحد من وسط الثقافة القاعدية العصبية باستخدام ماصة آلية سعة مليلتر واحد.

بعد ذلك ، قم بقياس كثافة الخلية باستخدام غرفة عد neubauer. أضف 10 ميكرولترات من تعليق الخلية واحسب عدد الخلايا تحت المجهر. ثم قم بإجراء الحسابات المقابلة للحصول على 40 إلى 80 ميكرولتر من تعليق الخلية ، والذي يحتوي على حوالي 30،000 خلية.

في صفيحة البئر الأربعة التي تحتوي على 500 ميكرولتر من الوسط القاعدي العصبي ، تم لعب حوالي 30،000 خلية لكل بئر تحتوي على زلات غطاء زجاجي. احتفظ بها في الحاضنة لمدة يومين إلى خمسة أيام في المختبر للخلايا العصبية الصغيرة أو أكثر من 15 يوما في المختبر للخلايا العصبية المسنة. في هذا الإجراء ، احتضان الخلايا بأقل من 2:00 صباحا لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

ثم انقل زلات الغطاء إلى غرفة الوفرة. بعد ذلك ، ضع غرفة الوفرة مع زلة الغطاء في الحامل على المجهر المقلوب. حدد المجال المجهري وقم ببث الخلايا باستمرار باستخدام HBS الدافئ.

بعد ذلك ، يضيء epi الخلايا عند 340 و 380 نانومتر. بالتناوب ، قم بتسجيل الضوء المنبعث من 520 نانومتر كل خمس إلى 10 ثوان باستخدام كاميرا الفلورسنت ، والتي يتم ترشيحها بواسطة مرآة fira two diic. لتحليل صور الفلورسنت المسجلة ، افتح أولا ملف التجربة باستخدام برنامج Aqua Cosmos ، وانقر فوق النسبة وحدد نطاق النسبة المطلوب.

احسب نسبة البكسل بالبكسل في الصور الناتجة من أجل الحصول على سلسلة من الصور النسبة. ثم اطرح الخلفية عن طريق ضبط زر إزالة الخلفية. بعد ذلك اضغط على بدء الحساب.

بعد ذلك ، اضغط على زر التسلسل الزمني بالكامل وامسح عائد الاستثمار القديم للتحليل الكمي للخلايا الفردية. إنشاء عائد استثمار جديد أو عائد استثمار يتوافق مع الخلايا العصبية الفردية. لرسم التسجيلات الفردية ، قم بتصدير قيم النسبة الفلورية المقابلة لكل عائد استثمار إلى برنامج مختبر Origin بالنقر فوق الرسم البياني.

ثم انقر فوق حساب وحفظ ملف TXT. بعد ذلك ، قم بإجراء الحساب المقابل لتقدير حجم الارتفاع في نسبة التألق استجابة لكل تحفيز للخلايا العصبية المستزرعة عبر باستخدام البلازميد المتحور لمعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا. أولا ، قم بإعداد 50 ميكرولترا من المحلول A الذي يحتوي على كاشف التعداء في قارورة.

بعد ذلك ، قم بإعداد 50 ميكرولتر من المحلول B الذي يحتوي على بلازميد معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا في قارورة. أضف المحلول B إلى المحلول A واحتضنه لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، انقل زلقات الغطاء التي تحتوي على الخلايا العصبية الحصين إلى أطباق متعددة جديدة تحتوي على 200 ميكرولتر من TF القاعدي العصبي الطازج. ثم أضف 100 ميكرولتر من المحلول A و B قطرة قطرة فوق كل زلة غطاء واحتضانها لمدة 30 دقيقة.

بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة الوسط. اغسل الخلايا باستخدام tf القاعدية العصبية الطازجة. بمجرد العودة ، ينزلق الغطاء إلى وسط الثقافة القاعدية العصبية الأصلي ويزرع الخلايا لمدة 24 ساعة بعد التعدي للسماح بالتعبير الفعال واستهداف المسبار.

بعد ذلك ، أضف أربعة ميكرولترات من مادة مانعة للتسرب TEREZIN N إلى 200 ميكرولتر من HBS لإعطاء تركيز نهائي يبلغ أربعة ميكرومولار. تخلط بلطف وتحتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد ساعتين ، ينزلق غطاء النقل إلى غرفة التروية واطلع عليه باستمرار باستخدام محلول HBS الدافئ.

لتسجيل صور التلألؤ الحيوي لتركيز الكالسيوم في الميتوكوندريا ، حدد المجال المجهري الذي يحتوي على الخلايا التي تعبر عن كورين APO كما هو موضح في انبعاث التألق. بعد ذلك ، أطفئ ضوء المجهر. قم بإزالة الصندوق الذي يحتوي على ثنائي اللون الموجود في مسار الضوء.

ثم أطفئ ضوء الإثارة وأغلق الصندوق المظلم للظلام الدامس. قم بتفريخ الخلايا بوسط HBS ، مع أو بدون محاليل اختبار دافئة مسبقا عند 37 درجة مئوية. ثم التقط صور الانبعاث الضوئي كل 10 ثوان باستخدام كاميرا عد الفوتون التي يتم التعامل معها بمعالج صور.

بعد ذلك ، أضف الحفر لإطلاق جميع الفوتونات المتبقية لتحليل الصور المضيئة بيولوجيا التي تعكس كالسيوم الميتوكوندريا. افتح صورة مضان GFP. حدد عائد الاستثمار الفردي عن طريق الرسم حول الخلايا المنقولة.

ثم انسخ والصق نفس عائد الاستثمار على كل صورة من التسلسل. لقطات الشاشة. بعد ذلك ، قم بتصدير قيم الانبعاث الضوئي لكل عائد استثمار إلى البرنامج المحدد للرسم البياني للنقر الحسابي.

لحساب قيم كل عائد استثمار ، حدد القيمة الإجمالية واستخدم عائد الاستثمار الحالي لجميع الصور. بعد ذلك ، اضغط على حساب ، واحفظ الملف النصي وتصدير البيانات. بعد ذلك ، قم بإجراء الحسابات المقابلة لتقدير حجم الارتفاعات في كالسيوم الميتوكوندريا استجابة لكل حافز معروض.

فيما يلي الصور الملونة الزائفة والتمثيلية للثقافات قصيرة وطويلة المدى للخلايا العصبية في الحصين قبل وبعد التحفيز بألوان أكثر دفئا و 100 ميكرومولار و MDA تعكس تركيز الكالسيوم العصاري الخلوي المرتفع. تظهر هذه الآثار التسجيلات التمثيلية لخلية واحدة لتركيز الكالسيوم العصاري الخلوي استجابة ل 100 ميكرومولار و MDA في الثقافات قصيرة وطويلة المدى للخلايا العصبية في الحصين. لاحظ أن زيادات تركيز الكالسيوم العصاري الخلوي أكبر بكثير على المدى الطويل منها في الخلايا العصبية المستنبتة على المدى القصير.

في هذه التجربة ، تم نقل الخلايا العصبية الحصينية المستزرعة مع الميتوكوندريا المستهدفة منخفضة التقارب الكورين المدمجة في GFP المحتضنة بأربعة تيريزين مانع تسرب ميكرومولار ، وتخضعت لتصوير التلألؤ البيولوجي لتركيز الكالسيوم في الميتوكوندريا. هنا ، التسجيلات التي تظهر إطلاق انبعاثات الصور التي تعكس كالسيوم الميتوكوندريا في الخلايا العصبية الحصين المزروعة على المدى القصير والطويل. زاد MDA 100 micromolar من تركيز كالسيوم الميتوكوندريا في الخلايا العصبية المسنة ، ولكن ليس في الخلايا العصبية الحصين الصغيرة المزروعة بعد هذا الإجراء.

يمكن دمج طرق أخرى مثل التقييم الأيسر العادل مع التصوير الفلوري والتلألؤ البيولوجي في نفس الخلايا من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل القابلية للإصابة بالخلايا العصبية ، والرصاص المرتبط بالشيخوخة والتنكس العصبي ونقص التروية.