مسمار الخرز في تطوير الدجاج أطراف الجنين لتحديد مسارات نقل الإشارة التي تؤثر على التعبير الجيني

الهدف العام من هذا الإجراء هو إظهار كيفية تحديد تأثيرات عوامل النمو والمثبطات ، في التعبير الجيني لأطراف جنين الدجاج النامية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا التطور ، مثل كيفية تأثير جزيئات الإشارات على نمو الخلايا وتمايزها في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر طريقة لاختبار هذه العوامل مباشرة في الجنين.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتطور الأطراف ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى ، مثل الأنسجة العصبية أو الجسيدات أو المعدة. ستظهر الإجراء ربيعة محمد ، طالبة دراسات عليا من مختبري. للبدء ، قم بنقل مليلتر واحد من الخرز من محلول المخزون الأصلي إلى أنبوب جديد.

اترك الخرزات تستقر ، ثم قم بإزالة السائل ، واستبدله بمليلتر واحد من PBS. كرر هذه الخطوة خمس مرات وقم بتخزين الخرز المغسول عند أربع درجات مئوية ، كملاط في PBS. حدد الخرزات للتطعيم ، عن طريق إزالتها من محلول المخزون المغسول باستخدام ماصة سعة 20 ميكرولتر ووضعها في مليلتر واحد من PBS.

باستخدام مجسم ، اختر الخرز الذي يبلغ قطره حوالي 100 ميكرون. انقل الخرزات المحددة في لترين صغيرين من السائل إلى طبق بتري جديد يحتوي على قطرة 20 ملليلتر من PBS بعد ذلك ، قم بإزالة PBS من الخرز. أولا، باستخدام ماصة سعة 20 لترا صغيرا، ثم قم بإزالة السائل المتبقي عن طريق الحركة الشعرية باستخدام ملقط صانع الساعات الدقيق.

من المهم إزالة أكبر قدر ممكن من السوائل حتى لا يتم تخفيف عامل النمو عند إضافته إلى الخرز. ماصة عامل النمو مباشرة على الخرز. بالنسبة إلى FGF18 ، أضف 0.5 ميكرو لتر من FGF18 المؤتلف ، وأعيد تكوينه أضف 0.5 ملليغرام لكل مليلتر في PBS مع 0.1 في المائة BSA.

ثم ضع عدة قطرات من الماء حول حواف الطبق لمنع السائل من التبخر. عندما تصبح جاهزا ، احتضن الخرز لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، قم بإزالة قطرات الماء من الطبق باستخدام ماصة باستور وضع الطبق على الثلج.

اشتقاق الخرزات ، باستخدام ملعقة أولا لنقل الخرزات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. ثم أضف ملليلتر واحد من حمض الفورميك العادي 0.2 واحتضن الخرزات في الحمض على منصة اهتزاز لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، اترك الخرزات تستقر ، وقم بإزالة حمض الفورميك واستبدله بمليلتر واحد من الماء.

اغسل الخرزات لمدة ساعة واحدة على منصة الاهتزاز وكرر الغسيل ست مرات لإزالة أي حمض فورميك متبقي. بعد الغسيل الأخير ، قم بإزالة السائل المتبقي وتخزين الخرز على أربع درجات مئوية. استخدم ملعقة لإزالة لوحة صغيرة من الخرز بحجم ما يقرب من خمسة إلى عشرة لترات صغيرة من المخزون ، وضع الخرزات في طبق بتري سعة 30 مل.

ثم أضف ملليلتر واحد من DMSO. بعد ذلك ، استخدم ماصة P2 مضبوطة على لترين صغيرين ، لنقل حبات قطرها حوالي 100 ميكرون ، إلى قطرة 20 ميكرو لتر من المذيب في طبق بتري آخر سعة 30 مل. قم بإزالة الجزء الأكبر من المذيب باستخدام ماصة سعة 20 ميكرو لتر وأي مذيب متبقي بماصة سعة لترين ميكرو.

بعد ذلك ، قم بتغطية الخرزات ب 20 لترا صغيرا من الدواء المراد تطبيقه ، مذابة في DMSO. احتضان الخرز في محلول الدواء لمدة ساعة واحدة. حماية الخرزات من الضوء ، لأن العديد من جزيئات الدواء حساسة للضوء.

للمساعدة في تصور الخرزات ، انقل أربعة إلى خمس حبات في لترين صغيرين من السائل ، إلى 20 لترا صغيرا من الفينول الأحمر المذاب في الماء. قم بإزالة حبة واحدة باستخدام ملقط صانع الساعات الناعم واشطف الخرزة في PBS. لا تترك الخرزات في محلول الفينول الأحمر لأكثر من 15 دقيقة قبل شطفها ، لأن ذلك قد يتسبب في فقدان النشاط.

قطع سلك التنغستن الناعم إلى أطوال من ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات ثم أدخل قطعة واحدة من السلك في نهاية ماصة باستور الزجاجية وقم بإذابها في موقد بنسن لتثبيتها في موضعها. قم بإعداد ما يصل إلى 10 إبر للتأكد من وجود قطع غيار في حالة تلفها. بعد ذلك ، ضع نهاية السلك في لهب شعلة النفخ واحتفظ به هناك حتى يضيء التنغستن باللون الأبيض ويصبح الطرف حادا.

يستغرق هذا حوالي دقيقتين إلى ثلاث دقائق. أضف خمس إلى ست قطرات من حبر الهند الفنان إلى 15 مل من PBS تحتوي على 100 وحدة من البنسلين و 0.1 ملليغرام من الستربتومايسين لكل مليلتر. لتحضير أجنة الدجاج ، احتضان البيض مع نهاية الحادة حتى تصل إلى المرحلة المرغوبة لمعظم التلاعب برعم الأطراف ، والتي عادة ما تكون من ثلاثة إلى خمسة أيام.

عند الوصول إلى النقطة الزمنية المطلوبة ، استخدم ملقطا غير حاد للنقر على الطرف الحاد للبيضة وكسر القشرة. ثم استخدم الملقط لإزالة القشرة وفضح الجنين. تأكد من إزالة غشاء خلية البويضة أيضا.

لتصور الجنين ، قم بحقن PBS مكملا ببضع قطرات من حبر الهند الفنان ، تحت الجنين بحقنة سعة مليلتر واحد وإبرة قياس 21. يمكن بعد ذلك إزالة الغشاء الزجاجي الذي يغطي الجنين باستخدام ملقط دقيق. بعد ذلك ، أضف ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من PBS المكمل مع مصل ربلة الساق الجنينية بنسبة واحد بالمائة ، و 100 وحدة لكل مليلتر من البنسلين ، و 0.1 ملليغرام لكل مليلتر من الستربتومايسين ، في البويضة لضمان عدم جفاف الجنين.

باستخدام ملقط صانع الساعات الحاد ، افتح السلى فوق براعم الأطراف النامية. في هذه المراحل ، يتحول الجنين عادة ، بحيث يكون الجانب الأيمن هو الجزء العلوي. تأكد من عدم جفاف الجنين عن طريق إضافة المزيد من محلول PBS المكمل عند الحاجة.

يمكن فتح السلى المحيط بالجنين باستخدام إبرة تنجستن دقيقة للكشف عن الطرف النامي. بعد ذلك ، استخدم سلك التنغستن الحاد لعمل شق في برعم الطرف حيث سيتم زرع الخرزة. تجنب قطع برعم الأطراف بالكامل ، حيثما أمكن ذلك.

على الرغم من أنه في المراحل الأصغر ، إلا أن هذا صعب. التقط حبة مطلية إما بعامل النمو أو الدواء باستخدام ملقط صانع الساعات الناعم للغاية. إذا تم نقع الخرزة إما في DMSO أو الفينول الأحمر ، فتأكد من شطفها باستخدام PBS قبل وضعها على الجنين.

انقل الخرزة إلى الجنين باستخدام الملقط ، ثم استخدم سلك التنغستن الحاد لإدخال الخرزة في موقع الشق. أضف ملليلترا إلى ملليلترين إضافيين من محلول PBS المكمل إلى البويضة لضمان الحفاظ على رطوبة الجنين. تجنب وضع المحلول مباشرة على الجنين نفسه ، لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلاف الجنين ويؤدي إلى إزاحة الخرزة.

بعد ذلك ، استخدم حقنة سعة عشرة ملليلتر ، مزودة بإبرة قياس 19 لإزالة كمية الألبومين المطلوبة فقط للتأكد من أن الجنين لا يتلامس مع الشريط المستخدم لإغلاق البويضة. تأكد من أن الإبرة لا تتلف صفار البيض ، عن طريق تحريكه لأسفل داخل القشرة. أخيرا ، أغلق البيضة بشريط لاصق وأعيدها إلى الحاضنة.

من أجل التأكد من أن FGF18 قادر على العمل من خلال منظمة مجاهدي خلق لفسفرة ERK ، تم حصاد الأجنة بعد ساعة واحدة من تطعيم الخرزة وتلطيخها بالمناعة لوجود ERK الفسفوري ، والذي يمكن رؤيته يحيط بالخرزة المطعمة في الصورة على اليمين. في المرحلة 21 من HH ، لا يتم التعبير عن MyoD في تطوير الأرومات العضلية الأطراف. على الرغم من أنه يمكن رؤية التلوين في عضل الجسيدات النامية.

ست ساعات من تطعيم حبة FGF18 ، يمكن رؤية MyoD مستحثا في الأرومة العضلية بالقرب من الخرزة. بينما لا يوجد تعبير في الطرف المقابل. يمكن تثبيط هذا التعبير عن طريق التطعيم المشترك لخرزة ، مغلفة بمثبط مجاهدي خلق مثل U0126.

وبالمثل ، فإن تطعيم حبة U0126 في المرحلة 21 من HH يقلل من التعبير الداخلي ل MyoD بعد 24 ساعة ، مقارنة بالطرف المقابل غير المعالج. في براعم الأطراف ، في المرحلة HH 19 ، لا يحفز FGF18 MyoD. ومع ذلك ، يمكن للتطعيم المشترك للحبات المنقوعة في FGF18 ومضاد حمض الريتينويك التغلب على ذلك ، ويتم الكشف عن MyoD خارج الرحم.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ثلاث إلى أربع دقائق ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. سمح تطوير هذه التقنية للباحثين في مجال بيولوجيا التنمية باستكشاف عوامل النمو التي تشير إلى نمو الجنين. أثناء محاولة هذه التقنية ، من المهم أن تتذكر عدم ترك الجنين يجف.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطعيم الخرز في الأجنة النامية لتحديد كيفية تأثير عوامل النمو التي تؤثر على النمو.