Name: قياس مرفق والتطبع الأنفلونزا A الفيروسات في خلايا A549 بواسطة التدفق الخلوي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: تعلم قياس مرفق والتطبع فيروس إنفلونزا A في خلايا A549 باستخدام التدفق الخلوي. تتيح هذه الطريقة للباحثين دراسة تفاعلات الفيروس مع الخلايا المضيفة بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31003A_135278) لطائرة أسرع من الصوت. MOP هو المستفيد من منحة الدكتوراه من صندوق البحوث AXA. نشكر باتريشيا Nigg للمساعدة في تصميم الشكل 1.

ملاحظة قبل البداية: غطاء محرك السيارة استخدام تدفق الصفحي والاحتواء المناسب عند العمل مع فيروسات حية. هنا، نحن تصف ظروف النمو المناسبة لسلالة فيروس الإنفلونزا الثقافة A / WSN / 33. قد تختلف وافر من العدوى (وزارة الداخلية) وحضانة مرات اعتمادا على سلالة الفيروس المستخدمة. 1. إعداد البيروكسيديز A / WSN / 33 الفيروسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور مادين-داربي kindey الكلاب (MDCK) الخلايا في قارورة T175 سم 2 باستخدام Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين، الستربتومايسين (القلم / بكتيريا). خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية حتى ما يقرب من 70٪ confluency يتم التوصل إليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الإصابة، وإزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، pH7.0-7.3) وذلك بإضافة كمية كبيرة كافية لتغطية أحادي الطبقة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني وتصيب الخلايا مع A / WSN / 33 مع وزارة الداخلية من 10 -4. تمييع الفيروس في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.02 ملغ المغنيسيوم 2+، 0.01 ملغ الكالسيوم 2+ &lt;/ سوب&gt;، 0.3٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، و 1٪ من ركلة جزاء / بكتيريا (العدوى PBS). استخدام اللقاح من 4 مل لT175 سم 2 قارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا 1 ساعة عند 37 ° C. إزالة اللقاح عن طريق الطموح وماصة 10 مل DMEM تستكمل مع 0.3٪ BSA، 20 ملي HEPES، و 1٪ من ركلة جزاء / بكتيريا في قارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 3 أيام حتى تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) مرئيا، ثم طاف الحصاد. ويمكن التعرف على CPE كما التقريب من الخلايا تليها مفرزة وموت خلايا 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور طاف في 450 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة الحطام الخلية. نقل طاف في أنبوب الصقر الجديد وكرر هذه الخطوة مرة أخرى. تجاهل الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatants نقل إلى أنابيب نابذة فائقة السرعة وsupernatants الأساس الذي تقوم عليه مع 5 مل من السكروز 30٪ المخفف في NTE العازلة (10 ملي تريس [الرقم الهيدروجيني 7.4]، 100 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA). موازنة الأنابيب قبل تنبيذ فائق وملء مع PBS للوصول إلى وحدة تخزين نهاية 30 مل. تدور supernatants في 112398 x ج (الموافق 25،000 دورة في الدقيقة لمدة الدوار SW28) لمدة 90 دقيقة في نابذة فائقة السرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية طاف قبل pipetting ونقع بيليه الفيروس بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في 250 ميكرولتر PBS. Resuspend بيليه بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. قياس محتوى البروتين من فيروس تنقيته بواسطة برادفورد مقايسة 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مجموعة biotinylation لتوليد المعقدة البيروكسيديز A / WSN / 33. اتبع تعليمات الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وباختصار، إضافة كمية مناسبة من البيوتين للفيروس المنقى واحتضان ل2H على الجليد. نقل الفيروس إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة وملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني للوصول إلى وحدة تخزين نهاية 30 مل. تدور الفيروس في 112389 x ج لمدة 90 دقيقة في نابذة فائقة السرعة. إزالة طاف قبل pipetting وإضافة 250 ميكرولتر PBS. نقع بيليه أكثر من ليلة 4 درجات مئوية. قسامة وتخزين الفيروس البيروكسيديز المخزنة في -80 ° C حيث أنها سوف تكون مستقرة لمدة 24 شهرا على الأقل. ملاحظة: قد يكون مفيدا لتحديد عيار من ع المعقدة البيروكسيديزجبر IAV بواسطة فحص اللوحة القياسية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن البروتوكول اللاحق سوف تقيس فقط جزيئات الفيروس المعقدة البيروكسيديز. سوف تبقى جسيمات unbiotinylated بسبب biotinylation ناقصة المساهمة في عيار المعدية عن طريق فحص اللوحة ولكن ليس على إشارة يقاس في فحص المرفق / تدخيل. </li></ol> 2. تحديد المبلغ المطلوب من الفيروسات المعقدة البيروكسيديز ملاحظة: قبل أن يتم تنفيذ فحص المرفق / تدخيل، فمن المهم تحديد كمية الفيروس المعقدة البيروكسيديز المطلوبة لتصيب جميع الخلايا لعينة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة والخلايا A549 يعرض للتريبسين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. عد الخلايا باستخدام غرفة الخلية. ماصة الخلايا 200،000 A549 إلى FACS deepwell الأنابيب. تدور 3 دقيقة في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه مع 200 ميكرولتر PBS. خلايا يبرد على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 5 أضعاف التخفيفات التسلسلي للbiotiالأسهم فيروس nylated في العدوى PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور تحتوي على خلايا في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه مع 100 ميكرولتر التي تحتوي على فيروس العدوى PBS. كما استخدام السيطرة وهمية العدوى PBS دون الفيروسات المعقدة البيروكسيديز. احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PBS. كرر هذه الخطوة مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتثبيت، وأنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 100 ميكرولتر من 3.7٪ امتصاص العرق (PFA). احتضان لمدة 10 دقيقة في RT. ثم، كرر الخطوة غسل موضح في 2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لpermeabilization، أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 100 ميكرولتر PBS تحتوي على 0.5٪ تريتون X-100. احتضان لمدة 6 دقائق في RT. ثم، كرر الخطوة غسل موضح في 2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيلوآخرون في 50 ميكرولتر 2٪ BSA مخففة في برنامج تلفزيوني يحتوي على STV-CY3. (يرجى ملاحظة، ينبغي تحديد التركيز المناسب من STV-CY3 قبل بدء التجربة تبدأ بتركيز 1: 200 و اختبار التخفيفات 2-أضعاف ما يصل الى 1: 2400 في أيدينا، والتخفيف من 1: 1000 أثبت ليكون أفضل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 1 ساعة في الظلام في RT. ثم، كرر غسل خطوة وصفها في 2.4 ولكن Resuspend وبيليه في 200 ميكرولتر 2٪ BSA مخففة في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل العينات عن طريق التدفق الخلوي 16. البوابة على السكان CY3 إيجابية. اختيار أقل تركيز من الفيروسات المعقدة البيروكسيديز مما أدى إلى أكبر عدد ممكن من خلايا CY3 إيجابية في عدد السكان A549. </li></ol> 3. تحديد المبلغ المطلوب من Streptavidin ملاحظة: كفاءة حجب إشارة المشتقة من الفيروس خارج الخلية تحدد اكتشاف مجموعة من الفحص. وبالتالي، فمن المهم لإلغاء إشارة STV-CY3 قدر الإمكان. عشرالبريد حاجة المبلغ المطلوب من STV يعتمد على كمية من الأوراق المالية الفيروسات المعقدة البيروكسيديز المستخدمة (المحدد في القسم 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات 2،1-2،4، ولكن استخدام تركيز الفيروس المحددة في القسم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التخفيفات المسلسل خمسة أضعاف من STV المخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 50 ميكرولتر STV التخفيف. كما استخدام السيطرة وهمية PBS تحتوي على 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم دون STV. احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة على الجليد. ثم، خطوة تكرار غسل وصفها في 2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات 2،5-2،9. لفحص الداخلي، واختيار أقل تركيز من STV مما أدى إلى كتلة قوية من CY3 إشارة (مقارنة مع العينة التي لم STV الحالي). لهذا، فإن النسبة المئوية للخلايا CY3 إيجابية أو كثافة مضان متوسط ​​للإشارة CY3 يمكن استخدامها. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون إشارة CY3 العينات STV معاملة أقرب إلى إشارة من المصابين ساخرةالخلايا وقت ممكن. </li></ol> 4. المرفقات / التطبع الفحص ملاحظة: تأكد من إعداد جميع الكواشف قبل بدء الفحص. لمجموعات المراقبة الثلاثة المقدمة في قسم النتائج (الخلايا المصابة وهمية، النورامينيداز خلايا ما قبل المعالجة وخلايا أزيد الصوديوم المعالجة) التعديلات الصغيرة على بروتوكول مطلوبة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 16 أنابيب deepwell تحتوي كل منها على 200،000 خلايا A549. إلى جانب مجموعة تجريبية مكونة من 4 أنابيب، وهناك 3 شروط السيطرة، يتطلب كل منها 4 أنابيب: خلايا وهمية المصابة، النورامينيداز (NA) خلايا -pretreated والخلايا المعالجة أزيد الصوديوم. وتتكون كل مجموعة من 4 أنابيب وصفها بأنها &#39;0 دقيقة&#39;، &#39;0 دقيقة + STV&#39;، &#39;30 دقيقة &#39;، &#39;30 دقيقة + STV &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور في 4 ° C في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيلوآخرون في 200 DMEM ميكرولتر تحتوي على 0.3٪ BSA، 20 ملي HEPES و 1٪ البنسلين ستربتومايسين (الحضانة المتوسطة). احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C. ملاحظة: للحصول على سيطرة النورامينيداز: استخدام النورامينيداز البكتيرية (مثل سياليداز من ضمة الكوليرا) بتركيز 200 مو / مل المخفف في الحضانة المتوسطة إلى resuspend الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PBS. كرر هذه الخطوة أكثر مرة واحدة، ثم أنابيب يبرد على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 100 ميكرولتر البيروكسيديز فيروس (استخدم تركيز الفيروس المحددة في القسم 2 مخففة في العدوى PBS). احتضان 1 ساعة على الجليد. ثم، خطوة تكرار غسل وصفها في 2.4. ملاحظة: للحصول على سيطرة وهمية المصابة: استخدم العدوى PBS دون الفيروس. لمراقبة أزيد الصوديوم: استخدام فيروس مخفف في العدوى PBS تستكمل مع 0.1٪ أزيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بروcessing من العينات بعد الإصابة على الجليد: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لعينات &#39;0 دقيقة &quot;، اتبع الخطوة 2.5 وتخزين العينات في 4 درجات مئوية حتى يتم إصلاح عينات أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل&#39;0 دقيقة + STV &quot;العينات، أنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 50 ميكرولتر STV (استخدام تركيز محدد في القسم 3) المخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم (لمنع تدخيل أثناء التعامل مع العينة). احتضان 30 دقيقة على الجليد. اتبع الخطوة 2،4-2،5 وتخزين العينات في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل &#39;&#39;30 دقيقة العينات، وأنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PBS تحتوي على 2٪ BSA. احتضان 30 دقيقة عند 37 ° C. اتبع الخطوة 2،4-2،5 وتخزين العينات في 4 درجات مئوية. ملاحظة: للحصول على سيطرة أزيد الصوديوم: استخدام PBS تستكمل مع 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم للحضانة 30 دقيقة عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ل &#39;30 دقيقة + عينات STV &quot;تدور الأنابيب في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر PBS تحتوي على 2٪ BSA. احتضان 30 دقيقة عند 37 ° C. ثم، وأنابيب تدور في 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في 450 ز س. إزالة طاف و resuspend بيليه في 50 ميكرولتر STV (استخدام تركيز محدد في القسم 3) المخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم (لمنع تدخيل أثناء التعامل مع العينة). احتضان 30 دقيقة على الجليد. اتبع الخطوة 2،4-2،5 وتخزين العينات في 4 درجات مئوية. ملاحظة: للحصول على سيطرة أزيد الصوديوم: استخدام PBS تستكمل مع 2٪ BSA و 0.1٪ أزيد الصوديوم للحضانة 30 دقيقة عند 37 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات 2،6-2،8 وتحليل العينات عن طريق التدفق الخلوي. تحديد النسبة المئوية للخلايا CY3 إيجابية في كل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب نسبة تعلق الفيروس والكمية النسبية للفيروس المنضوية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب كمية الفيروس المرفقة، استخدام النسبة المئوية من CY3-positiلقد الخلايا المغلقة أو متوسط ​​كثافة مضان إشارة CY3. وعلى سبيل المقارنة، تعيين الخلايا غير المعالجة إلى 100٪ (الشكل 4B). وصفت نسبة الفيروس التي توليها &quot;0 دقيقة&quot; عينة: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب كمية الفيروس المنضوية، تأخذ نسبة &quot;30 دقيقة + STV&quot; عينة إلى &quot;30 دقيقة&quot; عينة (الشكل 5B). ملاحظة: كما ذكر أعلاه، فإن النسبة المئوية للCY3 الخلايا المغلقة إيجابية أو كثافة مضان متوسط ​​للإشارة CY3 يمكن استخدامها. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+influenza+A+virus%3A+host+factors+and+antiviral+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets.</a> J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virolog%22">Fields Virolog</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).</li>
<li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).</li>
<li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+can+enter+and+infect+cells+in+the+absence+of+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis.</a> J Virol. 76, 10455-10464 (2002).</li>
<li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).</li>
<li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+influenza+A+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS Pathog. 7, e1001329(2011).</li>
<li>Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+entry+into+cells+lacking+sialylated+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+glycosylation+facilitates+sialic+acid-independent+attachment+and+entry+of+influenza+A+viruses+into+cells+expressing+DC-SIGN+or+L-SIGN%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN.</a> J Virol. 85, 2990-3000 (2011).</li>
<li>Wang, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN+mediates+avian+H5N1+influenza+virus+infection+in+cis+and+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans.</a> Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).</li>
<li>Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolidase+is+required+for+early+trafficking+events+during+influenza+A+virus+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry.</a> J Virol. 88, 11271-11283 (2014).</li>
<li>Konig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+host+factors+required+for+influenza+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human host factors required for influenza virus replication.</a> Nature. 463, 813-817 (2010).</li>
<li>Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cell+signalling+pathways+to+fight+the+flu%3A+towards+a+paradigm+change+in+anti-influenza+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemothe%22%5BJournal%5D)">Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy.</a> J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).</li>
<li>Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanisms+of+internalization+and+intracellular+delivery+mediated+by+pH-sensitive+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes.</a> Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).</li>
<li>Tran, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+specific+host+factors+protects+against+influenza+virus-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death%2C+and+disease%22%5BJournal%5D)">Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death.</a> Cell death, and disease. 4, e769(2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgramm+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Macey, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacey%2C+MG+%22Flow+Cytometry+Principles+and+Applications%22">Flow Cytometry Principles and Applications</a>. Macey, M. G. , Humana Press. (2007).</li>
<li>Burness, A. T., Pardoe, I. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+enzymes+on+the+attachment+of+influenza+and+encephalomyocarditis+viruses+to+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Viro%22%5BJournal%5D)">Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes.</a> J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يصف بروتوكول لدينا وسيلة سهلة لقياس مرفق الفيروس واستيعاب التدفق الخلوي. لأنها تتيح استخدام المسمى فيروس wildtype الذي يحاكي عن كثب العدوى بالفيروس مقارنة مع استخدام جزيئات الفيروسات مثل (فلب). في حين تم تحسين بروتوكول لدينا لقياس الحجز واستيعاب IAV يمكن بسهولة أن يتم تكييفها للفيروسات أخرى. بالإضافة إلى ذلك، كما يتم استخدام التدفق الخلوي للقراءات، وشارك في stainings يمكن بسهولة إضافة إلى بروتوكول على سبيل المثال لاختبار مستويات التعبير التالي ضربة قاضية أو overexpression...

دخول فيروس الانفلونزا (IAV) هو عملية متعددة الخطوات التي تبدأ مع ربط الفيروس إلى المستقبلات على غشاء البلازما من الخلايا المستهدفة 1. مستقبلات للIAV هو الحامض اللعابي التي هي موجودة على مجموعة كبيرة ومتنوعة من البروتينات السكرية والسكرية. وهيماغلوتينين (HA) البروتين من IAV التي هي موجودة في المغلف الفيروسي بربط الحامض اللعابي وبالتالي يتوسط مرفق من الجسيمات الفيروسية إلى غشاء البلازما من الخلايا المستهدفة 2. ويدخل الفيروس الخلايا عن طريق بوساطة بالكلاذرين الإلتقام ولكن أيضا مسارات دخول بديلة، مثل macropinocytosis، وقد وصفت 3-6. التفاعل بين HA والحامض اللعابي يبدو أن يكون كافيا للوساطة على حد سواء، والتعلق واثار استيعاب جزيئات فيروسية 7. ومع ذلك، فقد تم اقتراح مستقبلات دخول بديلة ويجري حاليا التحقيق دورهم في دخول IAV 1،8،9. لئيماهلدف اليوم، وبذل الجهود لتحديد العوامل المضيفة التي تشارك في دورة حياة الفيروس بهدف تطوير العلاجات المضادة للفيروسات حاجة ماسة رواية 10-12. ان دخول الفيروس سيكون خطوة إيجابية لاستهداف النمو IAV من أجل منع العدوى الفيروسية في أقرب نقطة له. قياس مراحل مختلفة من دخول IAV هو تحدي تجريبيا كما هو مطلوب كميات كبيرة من الفيروس عادة للكشف عن الفيروسات واردة. وبالإضافة إلى ذلك، ومجموعة الكشف عن التغييرات في دخول الفيروس خطي الوحيد نظرا لعدم وجود تكاثر الفيروس. وهذا يؤكد الحاجة لفحوصات مع حساسية عالية. مقايسة نقدم هنا يسمح للكشف عن فيروس تعلق على سطح الخلية وكذلك الكشف عن فيروس المنضوية في ما يتعلق المبلغ الإجمالي للفيروس الخلايا المرتبطة. استخدام فيروس wildtype المعقدة البيروكسيديز يمكن قياس مريحة من خلال تلطيخ مع STV-CY3 وقراءات التدفق الخلوي. فيروس المعقدة البيروكسيديز هو الباردة المنضم إلى خليةالصورة للسماح للمرفق ولكن منع تدخيل الجسيمات الفيروسية. الخلايا يمكن أن تكون ثابتة، permeabilized وملطخة STV-CY3 لقياس الفيروسات المرفقة. إشارة من خارج الخلية، virions المرفقة يمكن إلغاؤها إذا تم تطبيق خطوة حجب قبل التثبيت التي يتم تحضين الخلايا مع streptavidin غير المسمى (STV). في الخطوة التالية، بعد الحجز على المعقدة البيروكسيديز IAV، هو تحول درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، ويتم السماح استيعاب الجسيمات الفيروسية لتأخذ مكان. محمية جزيئات المنضوية من ربط STV مما يسمح للتمييز بين الفيروسات من خارج وداخل الخلايا. في حالة تجريبية، يطلب من أربع عينات: &#39;0 دقيقة&#39;: العينة الأولى، وصفت &#39;0 دقيقة، هو قياس فيروس البرد محددة على سطح الخلية. &#39;0 دقيقة + STV&#39;: النموذج الثاني، المسمى &#39;0 دقيقة + STV &quot;، ويعطي خط الأساس كثافة إشارة من التجربة. تم منع الفيروسات المرفقة الطرافةيجب أن تكون ح STV والإشارة التالية تلطيخ مع STV-CY3 أقل بكثير مقارنة مع عينة &#39;0 دقيقة. &#39;30 دقيقة &#39;: العينة الثالثة، &#39;30 دقيقة&#39; يحتوي المرفق والمنضوية الفيروس بسبب التحول درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. &#39;30 دقيقة + STV &#39;: العينة الرابعة، &#39;30 دقيقة + STV &quot;التدابير جزء داخل الخلايا من الفيروسات. يتم تطبيق الخطوة حجب STV بعد فترة الحضانة 30 دقيقة. ونتيجة لذلك، والجسيمات الفيروسية على سطح الخلية ملزمة STV ترك الفيروسات المنضوية متاحة فقط لتلطيخ مع STV-CY3. ويمكن حساب القيمة النسبية للفيروس المنضوية كنسبة من فيروس المنضوية (تقاس في دقيقة &#39;30 + STV &quot;عينة) مقسوما على المبلغ الإجمالي للفيروس (التي وصفها &#39;30 دقيقة &#39;العينة). والضوابط نقترح أن تتضمن خلايا وهمية المصابة. إشارة التالية STV-CY3 تلطيخ الخلايا وهمية المصابة يعطي الخلفيةالناتجة عن بروتوكول تلطيخ. عنصر تحكم لمرفق IAV هي المعالجة المسبقة من الخلايا البكتيرية مع النورامينيداز (NA). NA يشق قبالة الحامض اللعابي من بروتينات سكرية الخلوية، وبالتالي إزالة مستقبلات المرفق من سطح الخلية. أزيد الصوديوم (SA) هو المانع الأيضية قوية وبالتالي كتل الإلتقام 13. الخلايا تعامل مع أزيد الصوديوم يجب أن تكون إيجابية لفيروس ملزم ولكن السلبي لاستيعاب.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-052</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-169&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>VWR Calbiochem</td><td>126579</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Fluka</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Biosolve BV</td><td>20092391</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN KIT</td><td>فيشر Scientific</td><td><a href="https://extranet.fisher.co.uk/insight2_ch/getProduct.do?productCode=W9971E">W9971E&nbsp; < / a></td><td></td></tr><tr><td>Bio Rad Protein Bio Assay</td><td>Bio Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب ديب ويل (1.2 مل أنابيب دقيقة)</td><td>ميليان</td><td>82 00 001</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td> <td>& nbsp ؛ Lucerna chem&nbsp; علوم المجهر الإلكتروني</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب الطرد المركزي الفائق</td><td>Hemotec HmbH</td><td>253070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>STV-Cy3</td><td>Life Technologies</td><td>43-4315</td><td></td></tr><tr><td>STV</td><td>Life Technologies</td><td>43-4302</td><td></td></tr><tr><td>أزيد الصوديوم</td><td>Fluka</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>النيورامينيداز البكتيري / سياليداز</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>N6514-1UN</td><td></td></tr></tbody></table>

قياس مرفق والتطبع الأنفلونزا a الفيروسات في خلايا a549 بواسطة التدفق الخلوي

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

الارتباط بالخلايا المستهدفة متبوعا بالاستيعاب هي الخطوات الأولى في دورة حياة فيروس الأنفلونزا A (IAV). نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لقياس التغيرات النسبية في كمية الجسيمات الفيروسية التي ترتبط بخلايا A549 ، وهي خط خلايا ظهارية للرئة البشرية ، وكذلك في كمية الجسيمات التي يتم استيعابها في الخلية. نحن نستخدم الفيروسات الحيوية التي يمكن اكتشافها بسهولة بعد تلطيخها باستخدام الستربتافيدين المسمى Cy3 (STV-Cy3). نصف نمو وتنقية وبيوتينيل A / WSN / 33 ، وهي سلالة مختبرية IAV مستخدمة على نطاق واسع. يتم تلطيخ جزيئات IAV الحيوية المرتبطة بالبرودة على خلايا A549 ب STV-Cy3 ويتم قياسها باستخدام قياس التدفق الخلوي. للتحقيق في امتصاص الجسيمات الفيروسية ، يسمح للفيروس المرتبط بالبرودة باستيعاب 37 درجة مئوية. من أجل التمييز بين الجسيمات الفيروسية الخارجية والداخلية ، يتم تطبيق خطوة حظر: ترتبط بقع الارتباط الحرة على البيوتين للفيروس المتصل على سطح الخلية بالستربتافيدين غير المسمى (STV). ثم يتيح نفاذية الخلايا وتلبيخها اللاحق باستخدام STV-Cy3 اكتشاف الجسيمات الفيروسية الداخلية. نقدم عملية حسابية لتحديد الكمية النسبية للفيروس الداخلي. هذا الاختبار مناسب لقياس آثار العلاجات الدوائية أو التلاعب الآخر على ارتباط أو استيعاب IAV.

ويرد الكرتون واصفا الشروط الأربعة تجريبية مختلفة في الشكل 1 يتم عرض نتائج تجربة تمثيلية في الشكلين 2 - 5. في &quot;0 دقيقة&quot; عينة والفيروسات المعقدة البيروكسيديز بارد محددة لاستهداف الخلايا التي يمكن تصور من قبل STV-CY3 تلطيخ (الشكلان 1 و 2). عندما يتم تطبيق خطوة حجب (في &quot;0 دقيقة + STV&quot; عينة)، الفيروس على سطح الخلية لا يمكن الكشف عنها بواسطة STV-CY3 تلطيخ. ونتيجة لذلك، يتم تقليل كثافة إشارة في &quot;...

نقدم بروتوكولا يصف طريقة شبه كمية لقياس كليهما ، ربط فيروس الأنفلونزا A بخلايا A549 ، بالإضافة إلى استيعاب جزيئات الفيروس في الخلايا المستهدفة عن طريق قياس التدفق الخلوي.

قياس مرفق والتطبع الأنفلونزا A الفيروسات في خلايا A549 بواسطة التدفق الخلوي

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس ارتباط واستيعاب جزيئات فيروس الإنفلونزا A داخل خلايا A549 الظهارية الرئوية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق الربط البارد لفيروس الإنفلونزا A بالخلايا A549، مما يسمح بالارتباط ولكنه يمنع امتصاص الجزيئات الفيروسية.بعد ذلك، يُسمح للفيروس بالدخول إلى داخل الخلايا عن طريق تغيير درجة الحرارة إلى 37 °C. ثم يتم إجراء خطوة حجب، حيث يتم ربط strp Aden غير المسمى بسطح الخلية، وذلك بهدف التمييز بين الجزيئات الفيروسية الملتصقة وتلك التي دخلت إلى داخل الخلايا.أخيرًا، يتم تحضين الفيروس المبيوتني المرتبط بالخلايا مع ستربتاديفين المسمى بـ CY three، ويُستخدم قياس التدفق الخلوي للكشف عن الفيروسات المصبوغة. وفي النهاية، يتم حساب الكمية النسبية للفيروسات الملتصقة والممتصة داخليًا. وبالرغم من ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية حول الكمية النسبية من إنفلونزا، وهو فيروس يلتصق ويُمتص داخليًا في خلايا 5 0 9.يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على أنظمة أخرى باستخدام خطوط خلوية مختلفة أو فيروسات أخرى. بعد إنتاج الفيروس المبيوتني (biotinylated virus) وتحديد الكميات المطلوبة من الفيروس المسمى وstrep din وSI three labeled strep din وفقاً لبروتوكول النص، قم بتجهيز أربعة أنابيب ذات آبار عميقة يحتوي كل منها على 200,000 من خلايا A 5 49. قم بتسمية الأنابيب كالتالي: صفر دقيقة، صفر دقيقة زائد STV، 30 دقيقة، و30 دقيقة زائد STV. بعد ذلك، قم بتدوير الأنابيب باستخدام جهاز الطرد المركزي.قم بإزالة السائل الطافي واستخدم 200 µL من PBS لإعادة تعليق الرواسب. ثم بعد طرد الأنابيب مركزياً مرة أخرى، استخدم 200 µL من وسط نمو قياسي 5 49 لإعادة تعليق الخلايا، ثم حضنها عند 37 °C لمدة 30 دقيقة. بعد فترة التحضين، قم بطرد العينات مركزياً وأعد تعليق الرواسب في 200 µL من PBS. وبعد تكرار عملية الغسل مرة أخرى، قم بتبريد الأنابيب على الثلج لمدة 10 دقائق. وعندما تبرد الأنابيب، قم بطردها مركزياً مرة أخرى واستخدم 100 µL من الفيروس المبيوتني (biotinylated virus) المخفف في PBS العدوى لإعادة تعليق الرواسب. وبعد التحضين على الثلج لمدة ساعة واحدة، كرر عملية الطرد المركزي والغسل بـ PBS مرتين، مع معالجة العينات التالية بالتوازي قدر الإمكان بالنسبة لعينات الدقيقة صفر.بعد عملية الطرد المركزي، استخدم 100 µL من البارافورمالديهيد بتركيز 3.7% أو PFA لإعادة تعليق كتلة الخلايا المترسبة. قم بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل إجراء الطرد المركزي واستخدام PBS لغسل الخلايا مرتين بعد التثبيت. تُحفظ العينات عند درجة حرارة 4 °C حتى يتم معالجة جميع العينات.لمعالجة عينات الدقيقة صفر بالإضافة إلى STV، قم بطرد الأنابيب مركزياً، وأزل الطافي واستخدم 15 µL من STV بتركيز 2% BSA و 0.1% sodium azi في PBS لإعادة تعليق كتلة الخلايا المترسبة، ثم حضنها على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بالطرد المركزي واستخدم PBS لغسل الخلايا مرتين بعد التثبيت باستخدام PFA كما تم توضيحه للتو، واحفظ العينات عند درجة حرارة 4 °C بالنسبة لعينات الـ 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي وإزالة الطافي، استخدم PBS بتركيز 2% BSA لإذابة العينات.يتم التحضين عند 37 °C لمدة 30 دقيقة قبل الغسل بمحلول PBS والتثبيت باستخدام PFA. ثم تُحفظ العينات عند 4 °C لمدة 30 دقيقة بالإضافة إلى عينات STV. وبعد عملية الترسيب، نقوم بتعليق العينات في 200 µL من محلول PBS 2%BSA، بعد تحضينها عند 37 °C لمدة 30 دقيقة.قم بطرد الخلايا مركزياً وإعادة تعليقها في 50 µL من STV 2%BSA 0.1%Sodium azi في PBS، ثم حضنها على الثلج لمدة 30 دقيقة قبل الغسل والتثبيت. بعد ذلك، وبعد نفاذية وصبغ جميع العينات باستخدام STV SI three، وفقاً للتفاصيل الواردة في البروتوكول النصي، تُحفظ العينات عند درجة حرارة 4 °C. وأخيراً، يتم تحليل العينات بواسطة قياس التدفق الخلوي.حدد النسبة المئوية للخلايا الموجبة لـ CY three في كل عينة. احسب النسبة المئوية للفيروس الملتصق والكمية النسبية للفيروس الذي تم استيعابه داخلياً. وفقاً للبروتوكول النصي كما هو موضح هنا في عينة الصفر دقيقة، فإن الفيروس الملتصق يرتبط ارتباطاً بارداً بالخلايا المستهدفة كما هو موضح من خلال صبغة St.V.SI three.عند استخدام STV كخطوة حجب، لا يمكن بعد ذلك اكتشاف الفيروس الموجود على سطح الخلية بواسطة S St.V.SI، مما يؤدي إلى تقليل الإشارة بشكل كبير. وعندما تُرفع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، يتم امتصاص الفيروس الملتصق إلى داخل الخلايا. ولا يكون الفيروس الذي تم استيعابه داخلياً حساساً للحجب باستخدام STV غير المسمى، مما يؤدي إلى انخفاض أقل حدة في شدة الإشارة في عينات الـ 30 دقيقة بالإضافة إلى STV الموضحة.فيما يلي النسب المئوية للخلايا الموجبة لـ SI three لجميع الظروف التجريبية الموضحة في هذا الفيديو. تعطي الخلايا المصابة وهمياً شدة الإشارة الخلفية للتجربة وتعمل كعنصر تحكم سلبي لالتصاق الفيروس. أما التحكم الآخر، وهو النيورامينيداز، فيلغي بقوة التصاق IAV بنسبة 90% مقارنة بالخلايا غير المعالجة.أدى استخدام sodium azi، الذي يستنزف TP وبالتالي يثبط عملية الالتقام الخلوي، إلى تثبيط استيعاب الجسيمات الفيروسية أثناء وبعد العدوى؛ وكما هو موضح هنا، أظهرت الخلايا التي عولجت بـ sodium azi وحُضنت لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية انخفاضاً حاداً في الاستيعاب مقارنة بالخلايا غير المعالجة التي حُضنت في ظل الظروف نفسها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس الارتباط والاستيعاب لفيروس الإنفلونزا في خلايا 5 0 9. يتيح هذا البروتوكول قراءة مريحة عن طريق قياس التدفق الخلوي ويمكن تكييفه بسهولة مع إعدادات تجريبية أخرى.

measuring-attachment-internalization-influenza-virus-a549-cells-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

طريقة لقياس حركية الانصهار الفيروسي على مستوى الجسيمات واحدة

هذه الطريقة يصف استخدام الأشعة تحت الحمراء صبغ نظام التصوير القائم للكشف عن فيروس H1N1 في السائل قصيبية (بال) غسل من الفئران المصابة في حساسية عالية. لا يمكن أن يؤديها هذه المنهجية في 96 - أو 384 لوحة جيدا، يتطلب &lt;10 ميكرولتر من حجم المواد واختبار لديه القدرة على فحص متزامن من مسببات الأمراض متعددة.

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

وصفنا عزل الخلايا الأولية السريع للنوع الثاني الفئران السنخية الظهارية (وادي) عن طريق الانتقاء السلبي تدفق cytometric. هذه تظهر قابلية عالية وادي والنقاء ومناسبة لمجموعة واسعة من الدراسات الفنية والجزيئية بشأن دورها في أمراض الجهاز التنفسي مثل أمراض المناعة الذاتية أو المعدية.

عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

Source: Klaus, J. P., et al Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how to measure arenavirus attachment to monkey kidney cells. The assay uses low temperatures to block endocytosis and isolate the virus binding step. The approach enables precise quantification of surface-bound virus particles under conditions that restrict internalization.

An In Vitro Assay to Study Arenavirus Attachment to the Host Cell

في هذا الفيديو ، نناقش العلاقة بين CIT50 وتعدد الالتهابات الفيروسية. تظهر الخلايا المصابة بالفيروس تأثيرات اعتلال خلوي ، مما يتسبب في موتها وانفصالها عن القطب الكهربائي الصغير الذهبي ، مما يقلل بدوره من المقاومة.

المقايسة الخلوية القائمة على المعاوقة لقياس تعدد العدوى بفيروس الأنفلونزا

يوضح هذا الفيديو مقايسة الالتصاق البكتيري لتقييم الالتصاق البكتيري الموسوم ب GFP بزراعة الخلايا الظهارية لدراسة ديناميكيات تفاعلات المضيف والممرض باستخدام التصوير القائم على الفحص المجهري الفلوري.

الكشف عن التصاق البكتيريا بالخلايا المضيفة باستخدام التصوير الفلوري

يوضح هذا الفيديو فحصا يقيس التنشيط بوساطة الجسم المضاد لوظائف مستجيب الخلايا التائية. تؤدي إضافة جسم مضاد أحادي النسيلة خاص بفيروس الهيماجلوتينين (HA) إلى خلايا الثدييات المنقولة التي تعبر عن HA إلى تكوين مجمعات مناعية مع HA. عند إدخال الخلايا التائية المهندسة التي تعبر عن مستقبلات Fc ومراسل لوسيفيراز ، يتم تنشيط الخلايا التائية بواسطة مجمعات الأجسام المضادة-HA ، ويتم الكشف عن هذا التنشيط عن طريق إضافة ركيزة لوسيفيراز وقياس التلألؤ البيولوجي المنتج.

قياس تنشيط وظائف المستجيب بوساطة FC بواسطة الأجسام المضادة ل HA

الخطوة الأولى في دورة حياة فيروس الساحة هي ربط الجسيمات الفيروسية بالخلايا المضيفة. أبلغنا عن اختبار كمي قائم على (q) RT-PCR للكشف عن أحداث الارتباط بفيروس الساحة فائقة الحساسية وتقديرها.

الفحص حساس للغاية لقياس مرفق الفيروسة الرملية خلية

نصف مقايسة الليكتين المرتبط بالإنزيم (ELLA) لقياس عيار الأجسام المضادة المثبطة للأنفلونزا نورامينيداز (NA) في مصل. يستخدم الاختبار agglutinin الفول السوداني لتحديد بقايا الجالاكتوز التي يمكن الوصول إليها عندما يزيل NA حمض السياليك من الألواح المطلية بالفيتوين والمكونة من 96 بئرا.

قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص

يصف لنا طريقة لقياس تنشيط وظائف المستجيب بوساطة لجنة التيسير بالأجسام المضادة التي تستهدف هيماغلوتينين فيروس الإنفلونزا. يمكن تكييفها مع هذا التحليل أيضا لتقييم القدرة [مونوكلونل] أو [بولكلونل] سيرا استهداف glycoproteins السطحية الفيروسية الأخرى للحث على الحصانة بوساطة لجنة التيسير.

أسلوب لتقييم وظائف المستجيب Fc بوساطة الناجم عن الإنفلونزا هيماغلوتينين أجسام مضادة محددة

تم الإبلاغ هنا عن بروتوكول لقياس كمية الجسيمات الفيروسية المعدية باستخدام المراقبة في الوقت الفعلي للمعاوقة الكهربائية للخلايا المصابة. يتم تقديم تطبيق عملي لهذه الطريقة عن طريق تحديد مقدار تحلل فيروس الأنفلونزا A تحت معايير فيزيائية كيميائية مختلفة تحاكي الظروف البيئية.

رصد بقاء فيروس الأنفلونزا خارج المضيف باستخدام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي

تعلم قياس مرفق والتطبع فيروس إنفلونزا A في خلايا A549 باستخدام التدفق الخلوي. تتيح هذه الطريقة للباحثين دراسة تفاعلات الفيروس مع الخلايا المضيفة بدقة عالية.

قياس مرفق والتطبع الأنفلونزا A الفيروسات في خلايا A549 بواسطة التدفق الخلوي

استكشف المزيد من الفيديوهات