قياس مرفق والتطبع الأنفلونزا A الفيروسات في خلايا A549 بواسطة التدفق الخلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس ارتباط الأنفلونزا واستيعابها. جزيئات الفيروس في 5 49 خلية ظهارية رئوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق أول ارتباط بارد بواسطة الأنفلونزا ، وهو فيروس ب 5 49 خلية ، مما يسمح بالتعلق ولكنه يمنع امتصاص الجزيئات الفيروسية.

بعد ذلك ، يسمح للفيروس بالاستيعاب عن طريق تحويل درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. ثم خطوة حجب ترتبط فيها عدن غير المسمى بسطح الخلية. يتم إجراء الفيروسات المرفقة من أجل التمييز بين الجسيمات الفيروسية المرفقة والداخلية

أخيرا ، يتم تحضين الفيروس الحيوي المرتبط بالخلية مع CY ثلاثة تسمى ستربتافيدين ويستخدم قياس التدفق الخلوي للكشف عن الفيروسات الملطخة. في النهاية ، يتم حساب الكمية النسبية للفيروسات المرتبطة والداخلية على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للكمية النسبية للإنفلونزا ، وهو فيروس يرتبط ويستوعب 5 0 9 خلايا.

يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى باستخدام خطوط خلوية مختلفة أو فيروسات أخرى بعد توليد فيروس بيوتينيل وتحديد الكميات المطلوبة من البكتيريا العقدية للفيروس المسمى و SI ثلاثة تسمى البكتيريا العقدية وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد أربعة أنابيب آبار عميقة يحتوي كل منها على 200 ، 000 ، أ 5 49 خلية مصنفة الأنابيب على أنها صفر دقيقة. صفر دقيقة ، بالإضافة إلى STV ، 30 دقيقة و 30 دقيقة بالإضافة إلى STV. بعد ذلك ، قم بتدوير الأنابيب.

قم بإزالة المادة الطافية واستخدم 200 ميكرولتر من PBS لإعادة تعليق الكريات. ثم بعد تدوير الأنابيب مرة أخرى ، استخدم 200 ميكرولتر من وسط نمو قياسي 5 49 لإعادة تعليق الخلايا التي تحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بعد الحضانة ، وقم بالطرد المركزي للعينات وإعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من PBS بعد تكرار الغسيل مرة أخرى ، قم بتبريد الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقائق. عندما تبرد الأنابيب ، قم بالدوران مرة أخرى واستخدم 100 ميكرولتر من الفيروس الحيوي المخفف في PBS للعدوى لإعادة تعليق الكريات بعد احتضانها على الجليد لمدة ساعة واحدة ، كرر الدوران واغسلها باستخدام PBS مرتين ، ومعالجة العينات التالية بالتوازي قدر الإمكان لعينات الصفر دقيقة.

بعد الغزل ، استخدم 100 ميكرولتر من 3.7٪ ألدهيد باراكولافورم أو PFA لإعادة تعليق حبيبات الخلية. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل الدوران واستخدام PBS لغسل الخلايا مرتين بعد التثبيت. يحفظ على حرارة أربع درجات مئوية حتى تتم معالجة جميع العينات.

لمعالجة عينات دقيقة الصفر بالإضافة إلى عينات STV ، قم بتدوير الأنابيب وإزالة المادة الطافية واستخدم 15 ميكرولترا من STV 2٪ BSA و 0.1٪ صوديوم azi في PBS لإعادة تعليق حبيبات الخلية التي تحتضن على الجليد لمدة 30 دقيقة. ثم جهاز الطرد المركزي واستخدام PBS لغسل الخلايا مرتين بعد التثبيت باستخدام PFA كما هو موضح للتو ، قم بإغلاق العينات عند أربع درجات مئوية لعينات مدتها 30 دقيقة. بعد الدوران وإزالة الطابر النهائي ، استخدم PBS 2٪ BSA لإذابة العينات.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل غسلها باستخدام PBS وتثبيتها باستخدام PFA. ثم قم بتخزين العينات عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة بالإضافة إلى عينات STV. بعد التكوير ، نقوم بتعليق العينات في 200 ميكرولتر من PBS 2٪ BSA ، بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليقها في 50 ميكرولتر من STV 2٪ BSA 0.1٪ صوديوم أزي في PBS تحتضن على ICE لمدة 30 دقيقة قبل الغسيل والتثبيت. ثم بعد اختراق وتلوين جميع العينات باستخدام STV SI ثلاثة ، باتباع التفاصيل الواردة في بروتوكول النص ، قم بتخزين العينات عند أربع درجات مئوية. أخيرا ، قم بتحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي.

حدد النسبة المئوية لثلاث خلايا موجبة في كل عينة. احسب النسبة المئوية للفيروس المرتبط والكمية النسبية للفيروس الداخلي. وفقا لبروتوكول النص كما هو موضح هنا في عينة الدقائق الصفرية ، فإن الفيروس المرتبط بالخلايا المستهدفة كما هو موضح St.V.SI تلطيخ ثلاثي.

عندما يتم تطبيق STV كفيروس خطوة حجب على سطح الخلية لم يعد من الممكن اكتشافه بواسطة S St.V.SI ثلاثة تلطيخ يقلل بقوة من الإشارة. عندما ترتفع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية ، يتم امتصاص الفيروس المرتبط بالخلايا. الفيروس الداخلي ليس حساسا للحظر باستخدام STV غير المسمى مما يؤدي إلى انخفاض أقل دراماتيكية في شدة الإشارة في 30 دقيقة بالإضافة إلى عينات STV المعروضة.

فيما يلي النسب المئوية للخلايا الموجبة الثلاث في SI لجميع الحالات التجريبية الموضحة في هذا الفيديو. تعطي الخلايا المصابة الوهمية شدة إشارة الخلفية للتجربة وتعمل كعنصر تحكم سلبي لارتباط الفيروس. عنصر تحكم آخر يلغي ارتباط IAV بقوة بنسبة 90٪ مقارنة بالخلايا غير المعالجة.

عزي الصوديوم ، الذي يستنفد TP ، وبالتالي يثبط الالتقام الخلوي ، يثبط استيعاب جزيئات الفيروس أثناء وبعد العدوى ، كما هو موضح هنا بعد خلايا معالجة أزي الصوديوم المحتضنة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية أظهرت انخفاضا كبيرا في الاستيعاب مقارنة بالخلايا غير المعالجة المحتضنة في نفس الظروف. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس ارتباط واستيعاب الأنفلونزا ، وهو فيروس في 5 0 9 خلايا. يسمح هذا البروتوكول بالقراءة المريحة عن طريق قياس التدفق الخلوي ويمكن تكييفه بسهولة مع الإعدادات التجريبية الأخرى.