بروتوكول عزل فعال للاللمفاوية البائية والتائية من بلاطي اللوزتين الإنسان

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على كسور الخلايا الليمفاوية BNT من عينات اللوزتين البشرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الفيروسات ، مثل ما هي أدوار كسور الخلايا الليمفاوية BT في التسبب في الأمراض الفيروسية في غضون ثلاث ساعات من إزالتها الجراحية. نقل أنسجة اللوزتين إلى المختبر في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر مملوء بالمكملات الغذائية HBSS المعقمة المثلجة.

ثم استخدام إجراءات السلامة الحيوية المناسبة الموصى بها للتعامل مع الأنسجة البشرية. بلل الأنسجة بمكملات غذائية طازجة تحتوي على HBSS ونقل اللوزتين إلى صفيحة زراعة الخلايا البلاستيكية 60 ملم على الثلج. باستخدام الملقط ، قم بإزالة أي جلطات دموية مرئية أو أنسجة دهنية وضامة ، ثم انقل اللوزتين إلى صفيحة جديدة بحجم 60 ملم تحتوي على خمسة ملليلتر من HBSS مع المكملات الغذائية.

بعد ذلك ، قطع. يتكتل نسيج اللوزتين إلى شظايا من ثلاثة إلى 10 ملم ، متبوعا بنقل الشظايا إلى مصفاة خلية بلاستيكية 100 ميكرومتر في صفيحة ثقافة خلية جديدة 60 ملم تحتوي على 10 ملليلتر من HBSS الطازج مع المكملات الغذائية باستخدام نهاية المكبس لمحقنة بلاستيكية بسلاسة. اضغط على شظايا الأنسجة من خلال مصفاة الخلية ، وتأكد من بقاء شظايا اللوزتين مغمورة تماما في HBSS عندما يتم نقع جميع الأنسجة ، وتخلص من المصفاة وانقل تعليق الخلية الناتج إلى أنبوب طرد مركزي بلاستيكي سعة 50 مليلتر على الجليد.

اجلب محلول الخلية إلى الحجم النهائي البالغ 35 مل مع المكملات الغذائية الطازجة التي تحتوي على HBSS ، ثم أضف 10 مل من محلول التدرج بكثافة درجة حرارة الغرفة إلى عدد قليل من الأنابيب المخروطية سعة 50 ملليلترا. قم بتراكب معلقات الخلية برفق فوق تدرجات الكثافة ، مع الحرص على عدم خلط المحاليل ثم فصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ستنفصل الخلايا أحادية النواة إلى طبقة بيضاء ناعمة عند الواجهة مع خلايا الدم الحمراء والخلايا الليفية وحطام الخلايا الموجود في الرواسب في قاع الأنبوب.

باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر، اجمع طبقة الخلية أحادية النواة بعناية واسحب الخلايا أحادية النواة في أنبوب جديد سعة 50 ملليلترا. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات في 25 مل من PBS المثلج لكل غسلة وأعد تعليق الحبيبات النهائية في 15 مل من PBS. بعد حساب عدد الخلايا القابلة للحياة ، ضع الخلايا على الجليد لعزل الخلايا التائية عن طريق فصل الخرزة المغناطيسية.

قم بتدوير تعليق الخلية أحادية النواة وأعد تعليق الحبيبات في 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت لفصل الجليد البارد لكل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السبع. ثم انقل معلق الخلية إلى أنبوب معقم سعة ملليلتر واحتضانه في 20 ميكرولترا من الأجسام المضادة المغناطيسية الثلاثة لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية مع خلط لطيف مستمر للحفاظ على الخلايا والتعليق في نهاية الحضانة ، ونقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من عازلة فصل الجليد وغسلها أثناء الغسيل. قم بتوصيل الفاصل المغناطيسي بالحامل وقم بتحميل عمود على المغناطيس.

اغسل العمود ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفصل البرد المثلج ، ثم ضع مصفاة 40 ميكرومتر أعلى العمود. الآن أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفصل الطازج وقم بتحميل الخلايا من خلال المصفاة على العمود الذي يجمع الخلية B التي تحتوي على EIT في شكل مخروطي سعة 15 مل. اثنان من الجليد عندما تنتقل جميع الخلايا إلى أنبوب التجميع.

اغسل العمود أربع مرات ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفصل كل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا السبع في انتظار أن يكون خزان العمود فارغا قبل تطبيق الغسيل التالي. بعد الغسيل الأخير ، انقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد سعة 15 مل. ثم باستخدام مكبس العمود للضغط على ملليلترين من المخزن المؤقت للفصل عبر العمود في الأنبوب لجمع القرص المضغوط ثلاثة جزء موجب للخلايا التائية.

لتحليل كسور الخلايا المعزولة B و t tonsor ، قم بتكبيل القرص المضغوط ثلاثة موجبة و CD ثلاثة كسور خلية سالبة واغسل كلتا المجموعتين من الخلايا في ملليلتر واحد من PBS مكملا ب 0.2٪ BSA أو PBSA بعد الدوران الثاني. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من الخلايا و PBSA في العدد المناسب من الأنابيب لوضع العلامات على الفاكس ، وأضف الكمية المناسبة من الفلورو أربعة أحادي النسيلة المترافق أو الجسم المضاد للتحكم إلى كل أنبوب. ثم قم بدوامة الأنابيب لفترة وجيزة واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في الظلام في نهاية الحضانة.

اغسل الأنابيب مرتين باستخدام PBSA الطازج ثم قم بإصلاح تلطيخ الخلية ب 1٪ ألدهيد بارافورم للكشف عن وجود الحمض النووي للفيروس الغدي في الخلايا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بإجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في ظل ظروف ركوب الدراجات المناسبة ، وفصل منتجات تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الناتجة على هلام AGROS بنسبة 1.5٪ ومخزن EDTA بين العقارات. أخيرا ، تصور العصابات الناتجة مع بقعة الحمض النووي المناسبة.

وفقا للبروتوكولات القياسية ، يؤدي الفصل الناجح للخلايا أحادية النواة إلى مجموعات سكانية فرعية عالية النقاء من الخلايا الليمفاوية BNT كما أكد من خلال تحليل قياس التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل CD 20 و CD المضادة للكشف عن مجموعات الخلايا الليمفاوية B و t على التوالي. في المقابل ، ينتج عن الفصل غير الفعال للخلايا أحادية النواة كسور خلوية عبارة عن خليط من الخلايا من كل من الخلايا الليمفاوية B و t. يمكن استخراج المجموعات السكانية الفرعية والحمض النووي والحمض النووي الريبي من الخلايا الليمفاوية المفصلة ب و t المنفصلة عن الخرزة المغناطيسية لتحليلها كما هو موضح للتو.

على سبيل المثال ، هنا ، يظهر الكشف المحدد عن الحمض النووي للفيروس الغدي في الخلايا الليمفاوية التائية TONSOR كما تم اكتشافه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل سيتوبلازميا عالي الجودة. يمكن استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا الليمفاوية المعزولة من الخلايا الليمفاوية B NT أيضا. بمجرد الوحش ، يمكن معالجة عينتين من اللوزتين في غضون ست ساعات إذا تم تنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم معالجة عينات اللوزتين في أسرع وقت ممكن. يعد عدد خطوات الغسيل وحجم مخزن الغسيل أيضا من المعلمات الحاسمة للحصول على نتيجة جيدة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل QPCR و R-T-Q-P-C-R للإجابة على أسئلة إضافية حول الوجود الكمي للحمض النووي الفيروسي و mRNA بعد تطوره.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الفيروسات لاستكشاف التسبب في الأنواع الفيروسية المختلفة وزمن الانتقال إليها في الأنسجة اللمفاوية البشرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل كسور الخلايا الليمفاوية BT من عينات اللوزتين البشرية. لا تنس أن العمل مع مواد غير مفحوصة من أصل بشري مثل الدم والأنسجة قد يكون خطيرا للغاية.

لذلك ، يجب اتباع ممارسات السلامة المناسبة.