القياس الكمي لعمر اللافقاريات
تتوقف العديد من بشكل طبيعي عن النمو عند بلوغها سن الرشد ، وبعد ذلك تخضع للشيخوخة أو "الشيخوخة" حتى الموت. يطلق على مقدار الوقت بين ولادة الكائن الحي و…
تسمح تجارب القياس الكمي للعمر للعلماء بفحص التأثيرات الجينية والبيئية على عمر الكائن الحي. أثبتت الكائنات الحية النموذجية للافقاريات ، مثل ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء والدودة المستديرة Caenorhabditis elegans ، فائدتها للغاية في هذا الصدد. من خلال إجراء التجارب التي تقيس وتتعامل مع العمر الافتراضي في هذه الكائنات الحية ، بدأ العلماء في تحديد العوامل التي تؤثر على عملية الشيخوخة.
في هذا الفيديو ، ستتعرف على بعض المبادئ الكامنة وراء العمر والشيخوخة ، والبروتوكولات الأساسية لقياس العمر الافتراضي في الدودة وذبابة الفاكهة ، والطرق التي يتم بها تطبيق هذه التجارب.
قبل النظر في الإجراءات التجريبية لقياس العمر الافتراضي ، من المهم أولا فهم ما هو العمر الافتراضي والشيخوخة.
العمر الافتراضي هو مقدار الوقت الذي يعيش فيه الكائن الحي ويعمل ، بين الولادة والموت. قد تعيش بعض الكائنات الحية ، مثل العديد من النباتات ، نظريا إلى الأبد. وفي الوقت نفسه ، تتوقف معظم بشكل طبيعي عن النمو ، حتى في الظروف المثالية ، وبعد ذلك سوف تتقدم في العمر أو "تتقدم في السن" حتى تموت.
لا يفهم العلماء بعد تماما سبب شيخوخة الكائنات الحية. تم اقتراح أن العوامل المتنوعة ، بما في ذلك الإشعاع والأضرار الكيميائية من البيئة ، والمنتجات الثانوية السامة من عمليات التمثيل الغذائي الخاصة بنا ، تلعب دورا في الشيخوخة.
لدراسة هذه العوامل ، استفاد الباحثون من أوقات الجيل القصيرة للكائنات الحية النموذجية اللافقارية ، مثل الديدان والذباب ، والتي تسمح للعلماء بمراقبة أجيال متعددة على مدار أيام أو أسابيع ، بدلا من أشهر ، كما في حالة نماذج الثدييات مثل الفئران. كما أنها قابلة تماما للتلاعب الجيني ، مع العديد من الأدوات المتاحة التي تسمح بتشغيل جينات معينة أو إيقاف تشغيلها بسهولة لمراقبة آثارها على عملية الشيخوخة.
الآن بعد أن تعلمنا سبب كون نماذج اللافقاريات قابلة للغاية لدراسات الشيخوخة ، دعونا نلقي نظرة على كيفية إجراء تجارب لقياس العمر الافتراضي في الديدان. باختصار ، تتضمن هذه التجارب جمع الديدان الأم ، ومزامنة عمر ذريتها ، وعلاج ديدان اليرقات بدواء لمنع التكاثر ، وأخيرا نقل الديدان إلى ألواح الاختبار وعد الديدان الميتة أو الحية.
في بداية الإجراء ، من الضروري الحصول على عدد كاف من المطابقة للعمر عن طريق مزامنة مجموعة من الديدان مع جميع البيض في نفس الوقت. للقيام بذلك ، تترك الديدان الأولى على نفس لوحة الثقافة لمدة أسبوع تقريبا ، مما يسمح لها باستهلاك جميع الأطعمة المتاحة ، وبالتالي تسبب المجاعة. ستدخل بعض يرقات الديدان التي تتضور جوعا في حالة شديدة التحمل وتوقف النمو تسمى "dauer". ثم يتم نقل يرقات dauer هذه إلى طبق جديد. في هذه البيئة الغنية بالطعام ، ستستأنف يرقات الداور دورة حياتها وتصبح شبابا ناضجين من الناحية الإنجابية.
أخيرا ، بعد يومين ، يتم نقل هذه الديدان البالغة إلى طبق جديد آخر ويسمح لها بوضع البيض لمدة تصل إلى 24 ساعة. بمجرد الحصول على عدد كاف من البيض ، تتم إزالة البالغين من اللوحة ، ويتم تحضين البيض عند 20 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام للسماح للديدان بالفقس والنمو إلى مرحلة اليرقات L4.
لقياس عمر الديدان ، يتم نقل هذه اليرقات إلى صفائح تحتوي على عقار FUDR ، الذي يثبط تكاثر الديدان دون التأثير على عمر البالغين. على مدار التجربة ، لتحديد ما إذا كانت الديدان حية أم ميتة ، يمكن النقر على اللوحة لمراقبة حركة الدودة. بالنسبة للديدان الأكبر سنا ، قد يكون من الضروري حث رأس الدودة برفق للحصول على استجابة. قم بإزالة الديدان الميتة وسجل عدد الديدان الميتة والحية. يجب نقل إلى أطباق جديدة كل 2-3 أيام لتجنب المجاعة.
الآن بعد أن أظهرنا لك القياس الكمي للعمر في الديدان ، دعنا نفحص كيفية القيام بذلك في ذباب الفاكهة. باختصار ، يتضمن الإجراء السماح للإناث بوضع البيض في قفص خاص ، وجمع البيض ، والسماح لليرقات بالتطور إلى ذباب ، وفرز الذباب بناء على الجنس ، وأخيرا عد الذباب الميت الذي يظهر بمرور الوقت.
للحصول على ذباب متطابق مع العمر ، يتم وضع الذباب البالغ في قفص لجمع البيض ، والذي يحتوي على أطباق عصير الفاكهة المخططة بمعجون الخميرة. يتم غسل البيض الذي تم جمعه ووضعه في زجاجات نمو اليرقات وتحضنه لمدة 10 أيام تقريبا حتى يتطور الذباب. ثم يتم نقل الذباب البالغ من العمر يوما واحدا إلى زجاجات طعام للبالغين وتحضنها لمدة يومين للسماح لها بالوصول إلى مرحلة النضج الجنسي.
ثم يتم جمع هذه الذباب وتخديرها وفرزها إلى ذكور وإناث لتجنب الخلط بين قياسات العمر الافتراضي والعوامل الخاصة بالجنس. بعد ذلك ، يتم وضع الذباب أحادي الجنس في قوارير النمو. كل يومين ، يجب "قلب" الذباب إلى قوارير جديدة مع طعام طازج. يتم تسجيل الذباب الميت عن طريق حساب تلك المتبقية في القارورة القديمة ، وكذلك تلك التي سقطت في القارورة الجديدة.
الآن بعد أن تعلمت البروتوكولات الأساسية لقياس العمر الافتراضي في نماذج اللافقاريات ، دعنا نلقي نظرة على كيفية تكييف العلماء لهذه التقنيات لدراسة بيولوجيا الشيخوخة وطول العمر.
يدرس الباحثون تأثيرات عوامل مختلفة ، مثل درجة الحرارة والأدوية ، على العمر. في هذه الدراسة بالذات ، قام العلماء بزراعة الديدان في وسط سائل في ألواح ميكروتيتر مكونة من 96 بئرا ، بحيث يمكن اختبار تأثيرات المواد المتعددة وظروف النمو في وقت واحد. ووجدوا ، على سبيل المثال ، أن زراعة الديدان عند 25 درجة مئوية ، بدلا من 20 درجة مئوية ، قلل من عمر الديدان ، كما فعلت التركيزات العالية من عقار Mirtazepine المضاد للاكتئاب.
يمكن أيضا دمج فحوصات العمر مع تقنيات مثل تداخل الحمض النووي الريبي ، أو RNAi ، لتحديد الجينات التي تؤثر على بقاء. RNAi هي تقنية تجريبية قوية تستخدم الحمض النووي الريبي القصير لتقليل أو "ضربة قاضية" مستوى التعبير عن الجين المستهدف. هنا ، عالج العلماء الديدان باستخدام الحمض النووي الريبي ضد جين bec-1 ، ثم أصابوها بالبكتيريا المسببة للأمراض السالمونيلا وأجروا اختبار البقاء على قيد الحياة. أظهرت الديدان التي تم إسقاط bec-1 انخفاضا ملحوظا في العمر مقارنة بالديدان حيث يعبر الجين بشكل طبيعي.
أخيرا ، يتم استخدام تجارب القياس الكمي للعمر لتقييم تأثير ظروف النمو المختلفة على طول عمر. في هذه التجربة ، قام العلماء بزراعة الديدان المطابقة للعمر على سلسلة من الأطباق بكميات متفاوتة من الطعام البكتيري. وقد لوحظ أن نظام النمو هذا, يسمى تقييد السعرات الحرارية أو الغذائية, أن له تأثير كبير على عمر الديدان.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول القياس الكمي للعمر في نماذج اللافقاريات. ناقش هذا الفيديو بعض المبادئ الكامنة وراء الشيخوخة والعمر الافتراضي ، وبروتوكولات قياس العمر الافتراضي في الديدان والذباب ، وبعض تطبيقات تجارب قياس العمر الافتراضي. في النهاية ، الأمل هو أن تساعد هذه التجارب العلماء في العثور على العوامل والمسارات التي تتحكم في الشيخوخة ، وتسمح بتطوير علاجات لمعالجة الأمراض المرتبطة بالعمر ، مثل مرض الزهايمر وأمراض القلب والأوعية الدموية. شكرا للمشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
تسمح تجارب القياس الكمي للعمر للعلماء بفحص التأثيرات الجينية والبيئية على عمر الكائن الحي. أثبتت الكائنات الحية النموذجية للافقاريات ، مثل ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء والدودة المستديرة Caenorhabditis elegans ، فائدتها للغاية في هذا الصدد. من خلال إجراء التجارب التي تقيس وتتعامل مع العمر الافتراضي في هذه الكائنات الحية ، بدأ العلماء في تحديد العوامل التي تؤثر على عملية الشيخوخة.
في هذا الفيديو ، ستتعرف على بعض المبادئ الكامنة وراء العمر والشيخوخة ، والبروتوكولات الأساسية لقياس العمر الافتراضي في الدودة وذبابة الفاكهة ، والطرق التي يتم بها تطبيق هذه التجارب.
قبل النظر في الإجراءات التجريبية لقياس العمر الافتراضي ، من المهم أولا فهم ما هو العمر الافتراضي والشيخوخة.
العمر الافتراضي هو مقدار الوقت الذي يعيش فيه الكائن الحي ويعمل ، بين الولادة والموت. قد تعيش بعض الكائنات الحية ، مثل العديد من النباتات ، نظريا إلى الأبد. وفي الوقت نفسه ، تتوقف معظم بشكل طبيعي عن النمو ، حتى في الظروف المثالية ، وبعد ذلك سوف تتقدم في العمر أو "تتقدم في السن" حتى تموت.
لا يفهم العلماء بعد تماما سبب شيخوخة الكائنات الحية. تم اقتراح أن العوامل المتنوعة ، بما في ذلك الإشعاع والأضرار الكيميائية من البيئة ، والمنتجات الثانوية السامة من عمليات التمثيل الغذائي الخاصة بنا ، تلعب دورا في الشيخوخة.
لدراسة هذه العوامل ، استفاد الباحثون من أوقات الجيل القصيرة للكائنات الحية النموذجية اللافقارية ، مثل الديدان والذباب ، والتي تسمح للعلماء بمراقبة أجيال متعددة على مدار أيام أو أسابيع ، بدلا من أشهر ، كما في حالة نماذج الثدييات مثل الفئران. كما أنها قابلة تماما للتلاعب الجيني ، مع العديد من الأدوات المتاحة التي تسمح بتشغيل جينات معينة أو إيقاف تشغيلها بسهولة لمراقبة آثارها على عملية الشيخوخة.
الآن بعد أن تعلمنا سبب كون نماذج اللافقاريات قابلة للغاية لدراسات الشيخوخة ، دعونا نلقي نظرة على كيفية إجراء تجارب لقياس العمر الافتراضي في الديدان. باختصار ، تتضمن هذه التجارب جمع الديدان الأم ، ومزامنة عمر ذريتها ، وعلاج ديدان اليرقات بدواء لمنع التكاثر ، وأخيرا نقل الديدان إلى ألواح الاختبار وعد الديدان الميتة أو الحية.
في بداية الإجراء ، من الضروري الحصول على عدد كاف من المطابقة للعمر عن طريق مزامنة مجموعة من الديدان مع جميع البيض في نفس الوقت. للقيام بذلك ، تترك الديدان الأولى على نفس لوحة الثقافة لمدة أسبوع تقريبا ، مما يسمح لها باستهلاك جميع الأطعمة المتاحة ، وبالتالي تسبب المجاعة. ستدخل بعض يرقات الديدان التي تتضور جوعا في حالة شديدة التحمل وتوقف النمو تسمى "dauer". ثم يتم نقل يرقات dauer هذه إلى طبق جديد. في هذه البيئة الغنية بالطعام ، ستستأنف يرقات الداور دورة حياتها وتصبح شبابا ناضجين من الناحية الإنجابية.
أخيرا ، بعد يومين ، يتم نقل هذه الديدان البالغة إلى طبق جديد آخر ويسمح لها بوضع البيض لمدة تصل إلى 24 ساعة. بمجرد الحصول على عدد كاف من البيض ، تتم إزالة البالغين من اللوحة ، ويتم تحضين البيض عند 20 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام للسماح للديدان بالفقس والنمو إلى مرحلة اليرقات L4.
لقياس عمر الديدان ، يتم نقل هذه اليرقات إلى صفائح تحتوي على عقار FUDR ، الذي يثبط تكاثر الديدان دون التأثير على عمر البالغين. على مدار التجربة ، لتحديد ما إذا كانت الديدان حية أم ميتة ، يمكن النقر على اللوحة لمراقبة حركة الدودة. بالنسبة للديدان الأكبر سنا ، قد يكون من الضروري حث رأس الدودة برفق للحصول على استجابة. قم بإزالة الديدان الميتة وسجل عدد الديدان الميتة والحية. يجب نقل إلى أطباق جديدة كل 2-3 أيام لتجنب المجاعة.
الآن بعد أن أظهرنا لك القياس الكمي للعمر في الديدان ، دعنا نفحص كيفية القيام بذلك في ذباب الفاكهة. باختصار ، يتضمن الإجراء السماح للإناث بوضع البيض في قفص خاص ، وجمع البيض ، والسماح لليرقات بالتطور إلى ذباب ، وفرز الذباب بناء على الجنس ، وأخيرا عد الذباب الميت الذي يظهر بمرور الوقت.
للحصول على ذباب متطابق مع العمر ، يتم وضع الذباب البالغ في قفص لجمع البيض ، والذي يحتوي على أطباق عصير الفاكهة المخططة بمعجون الخميرة. يتم غسل البيض الذي تم جمعه ووضعه في زجاجات نمو اليرقات وتحضنه لمدة 10 أيام تقريبا حتى يتطور الذباب. ثم يتم نقل الذباب البالغ من العمر يوما واحدا إلى زجاجات طعام للبالغين وتحضنها لمدة يومين للسماح لها بالوصول إلى مرحلة النضج الجنسي.
ثم يتم جمع هذه الذباب وتخديرها وفرزها إلى ذكور وإناث لتجنب الخلط بين قياسات العمر الافتراضي والعوامل الخاصة بالجنس. بعد ذلك ، يتم وضع الذباب أحادي الجنس في قوارير النمو. كل يومين ، يجب "قلب" الذباب إلى قوارير جديدة مع طعام طازج. يتم تسجيل الذباب الميت عن طريق حساب تلك المتبقية في القارورة القديمة ، وكذلك تلك التي سقطت في القارورة الجديدة.
الآن بعد أن تعلمت البروتوكولات الأساسية لقياس العمر الافتراضي في نماذج اللافقاريات ، دعنا نلقي نظرة على كيفية تكييف العلماء لهذه التقنيات لدراسة بيولوجيا الشيخوخة وطول العمر.
يدرس الباحثون تأثيرات عوامل مختلفة ، مثل درجة الحرارة والأدوية ، على العمر. في هذه الدراسة بالذات ، قام العلماء بزراعة الديدان في وسط سائل في ألواح ميكروتيتر مكونة من 96 بئرا ، بحيث يمكن اختبار تأثيرات المواد المتعددة وظروف النمو في وقت واحد. ووجدوا ، على سبيل المثال ، أن زراعة الديدان عند 25 درجة مئوية ، بدلا من 20 درجة مئوية ، قلل من عمر الديدان ، كما فعلت التركيزات العالية من عقار Mirtazepine المضاد للاكتئاب.
يمكن أيضا دمج فحوصات العمر مع تقنيات مثل تداخل الحمض النووي الريبي ، أو RNAi ، لتحديد الجينات التي تؤثر على بقاء. RNAi هي تقنية تجريبية قوية تستخدم الحمض النووي الريبي القصير لتقليل أو "ضربة قاضية" مستوى التعبير عن الجين المستهدف. هنا ، عالج العلماء الديدان باستخدام الحمض النووي الريبي ضد جين bec-1 ، ثم أصابوها بالبكتيريا المسببة للأمراض السالمونيلا وأجروا اختبار البقاء على قيد الحياة. أظهرت الديدان التي تم إسقاط bec-1 انخفاضا ملحوظا في العمر مقارنة بالديدان حيث يعبر الجين بشكل طبيعي.
أخيرا ، يتم استخدام تجارب القياس الكمي للعمر لتقييم تأثير ظروف النمو المختلفة على طول عمر. في هذه التجربة ، قام العلماء بزراعة الديدان المطابقة للعمر على سلسلة من الأطباق بكميات متفاوتة من الطعام البكتيري. وقد لوحظ أن نظام النمو هذا, يسمى تقييد السعرات الحرارية أو الغذائية, أن له تأثير كبير على عمر الديدان.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول القياس الكمي للعمر في نماذج اللافقاريات. ناقش هذا الفيديو بعض المبادئ الكامنة وراء الشيخوخة والعمر الافتراضي ، وبروتوكولات قياس العمر الافتراضي في الديدان والذباب ، وبعض تطبيقات تجارب قياس العمر الافتراضي. في النهاية ، الأمل هو أن تساعد هذه التجارب العلماء في العثور على العوامل والمسارات التي تتحكم في الشيخوخة ، وتسمح بتطوير علاجات لمعالجة الأمراض المرتبطة بالعمر ، مثل مرض الزهايمر وأمراض القلب والأوعية الدموية. شكرا للمشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why are fruit flies and roundworms used to study aging and lifespan?
Invertebrate model organisms like Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans have short generation times, allowing scientists to observe multiple generations over days or weeks rather than months. They are also highly amenable to genetic manipulation with tools that enable specific genes to be turned on or off easily, making them ideal for examining genetic and environmental influences on aging.
Q2: What is the dauer stage and why is it important in worm lifespan experiments?
Dauer is a hardy, growth-arrested state that worm larvae enter when starved. To synchronize age-matched worms for lifespan studies, researchers induce dauer by starving worms on a culture plate for approximately one week. When transferred to food-rich environments, dauer larvae resume their life cycle and become reproductively mature, allowing scientists to obtain cohorts of uniformly aged animals for consistent experimental measurements.
Q3: How does FUDR treatment support lifespan measurement in worms?
FUDR is a drug that suppresses worm reproduction without affecting adult lifespan, making it essential for accurate lifespan quantification. By preventing reproduction, FUDR eliminates confounding variables from offspring and allows researchers to focus solely on measuring the survival of individual worms over time without interference from progeny.
Q4: What steps are involved in preparing age-matched fruit flies for lifespan studies?
Adult flies are placed in an egg collection cage with fruit juice-agar plates and yeast paste. Collected eggs are washed and incubated for about 10 days to develop into flies. One-day-old adults are transferred to food bottles for two days to reach sexual maturity, then anaesthetized and sorted by sex to avoid confounding lifespan measurements with sex-specific factors.
Q5: How can RNAi be combined with lifespan assays to study aging?
RNA interference, or RNAi, uses short RNAs to decrease the expression level of target genes. Scientists can treat worms with RNAi against specific genes, then perform survival assays to observe how gene knockdown affects lifespan. This technique helps identify genes that influence animal survival and aging processes by comparing lifespan in knockdown organisms versus controls with normal gene expression.
Q6: What environmental factors have been shown to influence invertebrate lifespan?
Temperature, drugs, pathogens, and diet significantly affect lifespan in invertebrate models. For example, growing worms at 25°C rather than 20°C decreased lifespan, as did high concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Caloric or dietary restriction has also been observed to have significant effects on worm lifespan, demonstrating how growth conditions directly impact longevity.
Q7: How are high-throughput lifespan experiments conducted in invertebrates?
Researchers culture worms in liquid media in 96-well microtiter plates to test multiple substances and growth conditions simultaneously. This approach allows scientists to screen the effects of various drugs, environmental factors, and genetic modifications on lifespan in parallel. The data generated helps identify pathways controlling aging and supports the development of therapies for age-related diseases like Alzheimer's and cardiovascular disease.