تحكم بوساطة رني من الأفلاتوكسين في الفول السوداني: طريقة لتحليل الإنتاج السموم الفطرية والتعبير التحوير في الفول السوداني / الرشاشيات Pathosystem

الهدف العام من هذا العمل هو توفير طريقة موثوقة ودقيقة وغير مكلفة وسريعة لاختبار فعالية إسكات الحمض النووي الريبي بوساطة جينات تخليق الأفلاتوكسين من الرشاشيات في الفول السوداني المعدح وراثيا باستخدام الحد الأدنى من البذور ، وعادة ما تكون هناك حاجة إلى مئات الجرامات من البذور لتحديد كمية الأفلاتوكسينات في العينات بشكل فعال. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم أقل من خمس بذور لاختبار علاج معين قبل 10 أيام من تحضير البذور ، وإعداد ثقافة الأفلاتوكسين الإيجابي aspergillus flavus NR RL 3 3 5 7 في وسط المثقاب ZAP Pex. ازرع هذه الثقافة عند 25 درجة مئوية.

سيتم استخدامه لتلقيح البذور. بعد تحضير النباتات المعدلة وراثيا التي تعبر عن RNAI ، والتي تم تفصيلها في بروتوكول النص ، استمر في حصاد بذورها. أولا ، قم بإزالة الكارب البريك باستخدام التآكل من غسالة الضغط المضبوطة على مستوى منخفض ، أو اكشط الكارب بيريك يدويا.

بمجرد إزالة مبروك البيري ، حدد لون الكارب المتوسط عن طريق وضع القرون على لوح النضج في المجموعات المناسبة. الآن قم بإزالة الثقوب ومعالجة البذور الصفراء والبنية بشكل منفصل. احسب عدد البذور اللازمة للتجربة ثلاث قطع بذور على الأقل ، مما يعني أن هناك حاجة إلى ثلاثة أنصاف من الرصاص المشترك لكل خط فول سوداني يتم أخذ عينات منه.

قم بتغطية قاع دورق معقم بطبقة من البذور ، ثم قم بتغطية البذور بحجم مقاس يبلغ 75٪ من الإيثانول. ثم ضاعف هذا الحجم. دع البذور تحتضن في المحلول لمدة 30 ثانية ، ثم اشطفها بالماء المقطر المعقم.

بعد ذلك ، عالج البذور بحجم 2٪ هيبوكلوريت كما هو الحال مع الإيثانول F. دع هذه الحضانة تستمر لمدة خمس دقائق. ثم استخدم ثلاث شطفات في خمسة أضعاف كميات من الماء المقطر المعقم.

لإزالة هيبوكلوريت ، من الأهمية بمكان غسل كل محلول هيبوكلوريت في هذه الخطوة. البذور الآن معقمة على السطح. بعد ذلك ، قم بترطيب البذور عن طريق غمرها في ماء مقطر معقم لمدة ساعتين محضرة لوضع البذور الرطبة على طبق بتري معقم.

يجب تعقيم جميع المواد في هذه المرحلة. قم بإزالة طبقات البذور باستخدام الملقط ، ثم افصل الكوهاين. أخيرا ، قم بإزالة الأجنة بمشرط.

يمكن التخلص من الأجنة أو استخدامها لتجديد نباتات جديدة. بعد ذلك ، قم بتقطيع الأولين إلى نصفين بمشرط واغمر النصفين والماء المقطر المعقم حتى يصبح جاهزا للتلقيح. بعد ذلك ، امسح الماء الزائد من نصف الرصاص على مناشف ورقية معقمة وضع قطع البذور في أطباق مثقاب منفصلة بنسبة 1.5٪ مع فتحات بحجم البذور ودس البذور فيها مع الجوانب المقطوعة لأعلى لتلقيح أنصاف الرصاص المشترك.

أضف ميكرولترين من 10،000 جراثيم الرشاشيات لكل معلق ميكرولتر إلى الأسطح المقطوعة. لا تدع التعليق ينساب على جانبي البذرة إلى النصف. أخيرا ، ضع الأطباق في حاضنة مظلمة على حرارة 30 درجة مئوية لمدة يوم إلى أربعة أيام حتى يتم اختبارها.

بعد يوم واحد ، وبعد يومين ، وبعد ثلاثة أو أربعة أيام من أخذ العينات ، تقوم البذور بإزالة النصفين الملقحين المختارين عشوائيا برفق حسب الحاجة. استخدم منديلا لمسح الجراثيم الزائدة والمثقاب وضع العينة في قارورة غطاء لولبي زجاجي. نقل العينات غير الملقحة إلى أنبوبين مليلتر لتحليل R-T-P-C-R.

قم بتحرير العينات في النيتروجين السائل وتخزين العينات المجمدة في الفريزر حتى تتم معالجتها. لتحليل الأفلاتوكسين ، احصل على نصف سرير الرصاص الملقح في قارورة غطاء لولبي زجاجي سعة أربعة مليلتر إذا لزم الأمر. ستكون العينة مستقرة لعدة أشهر عند سالب 80 درجة مئوية.

عندما تكون البذور في درجة حرارة الغرفة ، استخرج العينة عن طريق إضافة أربعة أحجام من الميثانول وترك الأنابيب تحتضن طوال الليل في الظلام في درجة حرارة الغرفة دون تحريض. في اليوم التالي ، قم بإجراء UPLC أولا ، وقم بإعداد عمود صغير من البروبيلين سعة 1.5 ملليلتر مع فريت مطابق. ثم أضف 200 ملليغرام من أكسيد الألومنيوم.

وبعد ذلك ، أدخل فريت آخر. الموضع التالي ، قارورة أخذ عينات السيارات A-U-P-L-C أسفل العمود الصغير وملامسة معه لتقليل التبخر. أضف الآن 0.5 مل من مستخلص الميثانول من العينة إلى كوب يمكن التخلص منه ، اثنان ، وليس من البلاستيك.

ثم أضف 0.5 مل من نتريل الأسيتو إلى الأنبوب واخلط المحاليل بماصة. الآن ضع 0.5 مل من الخليط على العمود الصغير المحضر واجمع EIT باستخدام الجاذبية فقط. بمجرد جمع EIT بسرعة ، قم بإرفاق غطاء للصرف الصحي بقارورة التجميع لاستخدامه في UPLC.

ضع القوارير في A-U-P-L-C المحضرة بالفعل بمرحلة متنقلة من تجربة الميثانول المائي والأسيدونيت. ثم حدد كمية محتوى الأفلاتوكسين في EITs. راجع بروتوكول النص لمزيد من التفاصيل جنبا إلى جنب مع تحليل UPLC.

قم بإعداد قطع البذور المستخدمة للاستخراج في قوارير زجاجية فردية. ثم قم بتجميد القوارير طوال الليل وقم بقياس الوزن الجاف لعينة الأنسجة في الصباح حتى يمكن التعبير عن تركيزات الأفلاتوكسين بالنانوجرام لكل جرام من العينة. ثم قم بإزالة العينات من الفريزر وأضف التريول وطحن الأنسجة المجمدة باستخدام مجانس مطحنة الخرز عند 3 ، 100 دورة في الدقيقة لمدة 40 ثانية وانتقل إلى استخراج الحمض النووي الريبي ، تم استخدام ناقل RNAI يحمل شظايا صغيرة من خمسة جينات تخليق الأفلاتوكسين من فلافيس لتحويل نباتات الفول السوداني.

تتوافق أرقام التعريف مع أرقام التعليقات التوضيحية للجينوم في المعهد الواسع من 99 محولات متجددة تم استنساخ سبعة خطوط إيجابية PCR واختبارها كما هو موضح. أظهرت السبعة جميعها تراكم أقل بنسبة 60 إلى 100٪ من الأفلاتوكسين مقارنة بخطوط التحكم. يتم تقديم نتائج من اثنين من الأسطر السبعة.

أظهر هذان الخطان RN الذكاء الاصطناعي وجود علامتين قابلتين للتحديد من NPT. وفقا لنتائج S-T-N-P-C-R ، كان التحكم السلبي المستخدم عبارة عن خط سلبي PCR مر بعملية التحويل لاختبار خطوط RNAi لقدرتها على مقاومة الأفلاتوكسين الذي تم حصاده حديثا كيديا من الأفلاتوكسين الإيجابي. تم تطبيق خط فلافيس NRRL 3 3 5 7 على نصف سرير الرصاص الذي يفتقر إلى الجنين والخصية بعد الحضانة لمدة تصل إلى 96 ساعة.

تمت معالجة الأنسجة الملقحة باستخدام UPLC لقياس مستويات الأفلاتوكسين كما هو موضح. تم تأكيد هذه النتائج بشكل أكبر من خلال قياس الطيف الكتلي للكروماتوغرافيا السائلة. بشكل عام ، أظهر RNAi 2 88 72 انخفاضا بنسبة 94 إلى 100٪ في الأفلاتوكسين B اثنين وانخفاضا بنسبة 90 إلى 100٪ في الأفلاتوكسين B واحد مقارنة بالسيطرة.

في حين أظهر RNAi 2 88 74 انخفاضا بنسبة 60 إلى 100٪ في كلا الأفلاتوكسينات. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام نفس مستخلصات البذور لتحليل phyto Xin من أجل فهم استجابة البذور للغزو الفطري بشكل أفضل. ستوفر هذه الطريقة أيضا أداة فريدة للمساعدة في تطوير تقنية RNAI للسيطرة على السموم الفطرية.