المواد الجزيئية الحيوية لوصف التفاعلات البكتيريا في استضافة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج مواد محاكاة حيوية تتكون من التصاقات مؤتلفة نقية ، إلى جانب حبات البوليسترين ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتشريح التفاعلات الكيميائية الحيوية والوظيفية بين التصاقات البكتيرية الفردية ومستقبلات الخلايا المضيفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تفاعلات مسببات الأمراض المضيفة مثل قياس التأثيرات على إشارات الخلية المضيفة وتثبيط السمية الخلوية بوساطة مسببات الأمراض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الالتصاقات المنقاة ، AEAs مقترنة اتجاهيا وتساهميا بجزيئات البوليمر التي تشبه في الحجم البكتيريا وبالتالي تحاكي عرض سطح البكتيريا.

عرض الإجراء معي طالب دكتوراه TU A-C-E-D-A من مختبرنا. سيتم عرض اقتران اتجاهي ثال أمين هنا. هذا البروتوكول مناسب لاقتران البروتينات المحتوية على السيستين بحبات البوليمر الوظيفية باستخدام SUL succinyl ل p meli phenyl butyrate ، أو SMPB كعامل ربط متقاطع ، قم بإعداد جميع الكواشف اللازمة قبل الاستخدام مباشرة كما هو موضح في نص البروتوكول لبدء إجراء تنشيط الخرزة.

قم بخلط تعليق حبة عن طريق التقليب برفق ثم نقل الكمية المطلوبة من تعليق الخرزة إلى أنبوب معقم سعة 1.5 ملليلتر. تحتوي على مليلتر واحد من PBS المعقم ، ودرجة الحموضة 7.0 ، ماصة برفق لأعلى ولأسفل لغسل الخرزات والحبيبات عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي صغير. ضخم إزالة بعناية مع ماصة وندبة.

ريس بتعليق حبيبات الخرزة في ملليلتر واحد من PBS المعقم الطازج وكرر خطوة الغسيل. أعد تعليق حبة الحبة. في 0.8 مل من PBS ، أضف 200 ميكرولتر من 10 ملليمولار SFO SMPB المحضرة حديثا.

لإعطاء تركيز نهائي يبلغ ملليمولات ، احتضان تعليق الخرزة لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية على عجلة دوارة أثناء احتضان الخرز. قم بإعداد البروتين لخطوة الاقتران التالية حتى يمكن إضافته على الفور إلى الخرز المنشط. تحقق من تركيز البروتين واضبطه على التركيز النهائي المطلوب لتفاعل الاقتران. ستة.

عادة ما يتم استخدام ميكرومولار من البروتين و PBS وحجم مليلتر واحد لتقليل البروتين. أضف محلول مخزون TEP لإعطاء تركيز نهائي يبلغ خمسة مللي ضرس. احتضان المحلول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، احتفظ ببضعة ميكرولترات من محلول البروتين لتحديد تركيز البروتين الأولي وحساب كفاءة الاقتران.

ابدأ إجراء اقتران البروتين عن طريق تكوير الخرز المنشط وغسل الحبيبات. مرة واحدة في مليلتر واحد من PBS الطازج المعقم ، أعد تعليق الحبيبات في محلول البروتين المحضر لإعطاء تركيز البروتين المطلوب. احتضان معلق حبة البروتين لمدة ساعتين عند 25 درجة مئوية على عجلة دوارة بعد ساعتين ، قم بإلغاء تنشيط المجموعات المنشطة المتبقية على الخرزات عن طريق إضافة محلول مخزون سيستين إلى تركيز نهائي يبلغ 50 مليمولار واحتضانه للتعليق لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية على عجلة دوارة.

عقدت الخرز عن طريق الطرد المركزي. احتفظ ب snat لتحديد تركيز البروتين وحساب كفاءة التوصيل. اغسل حبيبات الخرزة مرتين بمليلتر واحد من PBS و Resus bend ومليلتر واحد من PBS الطازج لإعطاء المنتج النهائي قبل يوم واحد من المنافسة فحص البذور كل بئر من 24 صفيحة بئر مع ملليلتر واحد من خلايا هيلا بتركيز 150 ، 000 خلية لكل مليلتر.

سيسمح ذلك للخلايا بالوصول إلى ما يقرب من 80٪ من الطلاقة المشتركة قبل بدء التجربة. تلقيح استزراع LB بحري سعة خمسة ملليلتر بمستعمرة جديدة من V para الانحلالي وتنمو بين عشية وضحاها عند 30 درجة مئوية مع الرج. قم بإعداد جزيء التصاق متعدد التكافؤ مقترن بالخرزة بما يكفي كما هو موضح سابقا.

اسمح ب 100 ميكرولتر من 10 × مخزون حبة لكل بئر أو تركيز نهائي من 500 نانو مولار بروتين في يوم فحص المسابقة. قم بقياس OD 600 للثقافة البكتيرية. قم بإعداد وسائط العدوى عن طريق تخفيف المزارع البكتيرية إلى DMM عديم اللون بدون إضافات.

التسخين المسبق إلى 37 درجة مئوية تحتوي على 10٪ من الحجم إلى تعليق الضرب. لإعطاء وزارة الداخلية 10 ، قم بإعداد مليلتر واحد لكل بئر و 10 إلى 20٪ حجم زائد لكل عينة. قم بإزالة الوسط القديم من الآبار واغسل المستنبت.

شفاء الخلايا عن طريق إضافة مليلتر واحد من PBS المعقم إلى 37 درجة مئوية. قم بإزالة PBS وأضف ملليلترا واحدا من وسط العدوى لكل بئر. أضف المحاليل التي تحتوي على حبات التحكم والبكتيريا كعناصر تحكم إيجابية وخرز التصاق ولا توجد بكتيريا سلبية. عناصر التحكم.

أضف DMM التي تحتوي على 0.1٪ TRITTON X 100 كأدوات تحكم في التحلل. قم بإعداد كل شرط تجريبي بما في ذلك عناصر التحكم ثلاث نسخ. احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمقدار الوقت المطلوب.

يتم تقييم السمية الخلوية. أربع ساعات بعد الإصابة. قم بإزالة 200 ميكرولتر من كل بئر مستخدم في لوح 24 بئر وانقله إلى لوح جديد مكون من 96 بئر.

قم بتدوير لوحة البئر 96 عند 1 ، 500 جم لمدة خمس دقائق وانقل 100 ميكرولتر من كل بئر إلى طبق 96 بئر جديد. أضف 100 ميكرولتر من الوسائط المستخدمة أثناء تجارب العدوى إلى ثلاثة آبار جديدة من صفيحة البئر 96 لاستخدامها كفراغات. قم بإجراء مقايسة إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات باستخدام مجموعة أدوات الكشف عن السمية الخلوية LDH واتباع تعليمات الشركة المصنعة.

أولا ، احسب كمية الكاشف المطلوبة بزيادات قدرها 25. على سبيل المثال ، ل 100 عينة. امزج 11.25 مل من الكاشف A مع 250 ميكرولتر من الكاشف B مقلوب لتجنب الرغوة لا تدوام.

بعد ذلك ، ضع الخليط في خزان. ثم أضف 100 ميكرولتر من مزيج الكاشف إلى كل عينة واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة في 10 و 20 و 30 دقيقة. اقرأ الامتصاص عند 490 نانومتر على قارئ اللوحة.

بعد ذلك ، احسب النسبة المئوية للسمية الخلوية كما هو موضح في المخطوطة ، ويتم إجراء قياسات الالتصاق البكتيري بعد ساعة واحدة من الإصابة. قم بإزالة الوسائط من طبقة الخلية واغسل طبقة الخلية جيدا باستخدام PBS معقم للتدفئة المسبقة لإزالة أي خلايا غير متصلة. اغسل ما لا يقل عن ثلاث إلى أربع مرات باستخدام مليلتر واحد من PBS في كل مرة ليز للخلايا المضيفة عن طريق إضافة مليلتر واحد إلى كل بئر من حجم معقم 1٪ إلى حجم محلول Triton X 100 في PBS احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

ماصة كل عينة لأعلى ولأسفل عدة مرات قبل نقل محتويات كل بئر لكل منهما منفصلة. أنابيب 1.5 ملليلتر. قم بإعداد تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف للعينات في لوحة PBS معقمة ، 100 ميكرولتر من كل عينة على أجار LB البحري وانتشرها باستخدام موزع خلية لتحسين التخفيف إلى اللوحة اعتمادا على السلالات البكتيرية والنقطة الزمنية لهذا الإعداد التجريبي.

سيعطي التخفيف من 10 إلى الخامس أو 10 إلى السادس عددا مناسبا من CFUs. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في اليوم التالي ، وتعداد البكتيريا عن طريق عد المستعمرات. في فحوصات المنافسة ، أصيبت خلايا الكعب بسلالة V para الانحلالية.

فقير واحد مشار إليه مع إيجابية أو ترك غير مصاب في وجود كيانات منافسة مختلفة. أدت العدوى في المختبر بفقر إلى مستويات عالية جدا من تحلل الخلايا التي تم تثبيطها بواسطة خرز MAM السبعة المقترنة ، ولكن ليس خرز MA'AM المقترن أو الخرز المقترن بضريبة السلع والخدمات. تعداد الشلل الخامس المرتبط إما بخلايا HELOC غير المعالجة أو الخلايا المحتضنة مع MAM.

كشفت سبع حبات تحكم MAM أو ضريبة السلع والخدمات أن MAM. سبع حبات ولكن ليس MAM واحد أو حبات التحكم في ضريبة السلع والخدمات. تفوق على الخامس الانحلالي للتعلق بمستقبلات سطح الخلية المضيفة.

الالتصاقات مقترنة بالفلورو. يمكن أن تحاكي أربعة حبات مصنفة الالتصاق البكتيري بالخلايا المضيفة وهي أدوات قوية للتصوير الخلوي. يحتوي الأنبوب الموجود على اليمين على تعليق من حبات المحاكاة الحيوية الزرقاء الفلورية. مام.

تم استخدام سبعة حبات زرقاء فلورية مقترنة لتوصيف عملية MAM سبعة تعلق بوساطة للخلايا الظهارية. أدى ربط MAM سبعة بالخلايا المضيفة إلى إعادة ترتيب الأكتين وتشكيل ألياف الإجهاد التي تم تصورها باستخدام Rumine Phin لتلطيخ الأكتين. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تنقية التقارب إلى جانب البروتينات أو اللطخة الغربية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل العوامل الخلوية المضيفة التي تشارك في عمليات الإشارات في اتجاه مجرى الارتباط البكتيري.