والسكتة الدماغية تنوعا فأري موديل تحت القشرية الأبيض المسألة لدراسة محور عصبي تنكس والأبيض المواد بيولوجيا الأعصاب

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد موقع سكتة دماغية صغيرة بدقة داخل المادة البيضاء لدى الفئران لنمذجة هذا الشكل الشائع من السكتات الدماغية في المادة البيضاء تحت القشرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال السكتات الدماغية، مثل آليات الإصابة المحورية، والاستجابة العصبونية للسكتة تحت القشرية، وكيفية استجابة العناصر الخلوية للمادة البيضاء خلال مرحلتي السكتة الحادة والترميم. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية استخدامها لتحديد موقع السكتة الدماغية بدقة في المادة البيضاء، وإمكانية تطبيقها على مجموعة متنوعة من نماذج الفئران.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات، وذلك بسبب كمية المادة البيضاء الصغيرة التي تؤدي إلى تحديد موقع السكتة الدماغية بشكل خاطئ. قد يتطلب الأمر إجراء تعديلات طفيفة على زاوية الحقن أو الإحداثيات التجسيمية لكل سلالة من الفئران، أو على إعداد التجسيم. ابدأ أولاً بتثبيت ماصة زجاجية مسحوبة في أنبوب متصل بخط تفريغ.

أدخل الطرف المسحوب في محلول L-Nio، أو محلول L-Nio المضاف إليه المقتفي الفلوري. ابدأ بتشغيل المكنسة الكهربائية، وقم بعملية الشفط حتى يتم ملء ما لا يقل عن 2 mm من الجزء الذي يبلغ قطره 0.5 mm من الماصة. ضع الماصة المملوءة جانباً.

بعد ذلك، ضع الفأر في جهاز تثبيت مجسم (stereotactic apparatus) مجهز بمجهر مجسم. بعد تخدير الفأر وتحضيره للجراحة وفقاً للإجراءات المعتمدة، تحقق من عمق التخدير عن طريق قرص إصبع القدم؛ حيث يجب ألا يكون هناك أي استجابة.

بعد ذلك، قم بضبط ذراع الحقن على زاوية 36 درجة. ثبّت حامل ماصة زجاجية مسحوبة في الطرف البعيد لنظام حقن ضغطي منخفض الحجم، وقم بتوصيله بذراع الحقن. بعد إجراء شق في خط منتصف فروة الرأس بطول 1.5 سنتيمتر للكشف عن الجمجمة، جفف سطح الجمجمة باستخدام مسحة قطنية.

بعد ذلك، وأثناء النظر عبر مجهر ستيريوتاكسيك (stereotactic microscope) بتكبير يتراوح من 1 إلى 3X، استخدم أداة ذات رأس دقيق لإزالة أي أنسجة سمحاقية مغطية. حدد نقطة البريغما (bregma) باستخدام قلم تحديد دقيق. ثم استخدم مثقاباً جراحياً مجهزاً بريشة مثقاب جراحية دقيقة الرأس لإجراء عملية ثقب جمجمة بيضاوية بقطر 2 ملم، تبدأ من الجهة الخلفية عند البريغما وتمتد للأمام إلى يسار الخط الناصف مباشرة.

قم بإزالة شظايا العظام والأنسجة الرخوة التي تعلوها بحيث يمكن رؤية القشرة المخية. حافظ على رطوبة سطح القشرة عن طريق وضع قطرات من المحلول الملحى المعقم بشكل متقطع. بعد ذلك، قم بتثبيت الماصة المملوءة بذراع المحقن.

قم بمحاذاة الطرف القاصي للماصة مع البريغما (bregma)، ثم قم بتصفير الإحداثيات التجسيمية. حرّك الماصة إلى نقطة الحقن الأولى باستخدام الإحداثيات الأمامية، والخلفية، والإنسية-الوحشية المدرجة في الجدول 1. بعد ذلك، حرّك الماصة حتى تصل إلى سطح القشرة المخية، وقم بتصفير قياس الاتجاه الظهري-البطني.

قم بخفض الماصة ببطء إلى الإحداثيات الظهرية-البطنية. تأكد من ضبط تكبير المجهر التجسيمي على 3X، ومن إمكانية رؤية الشبكة المرجعية المعايرة بوضوح. انظر إلى الماصة المائلة من الجانب بحيث يكون سطح السائل المقوس في عرض سهمي.

يجب أن يظهر السطح المقعر في نفس المستوى البؤري لكل من الجدار الداخلي والخارجي للماصة. الآن، وباستخدام نظام حقن بالضغط الموضعي مضبوط على 20 PSI لنبضات مدتها 20 millisecond، احقن 100 nanoliters من L-Nio في الدماغ. بعد حقن الحجم الإجمالي، انتظر لمدة خمس دقائق لمنع الارتجاع عبر مسار الماصة.

بعد ذلك، اسحب الماصة، وكرر إجراء الحقن عند المجموعة الثانية والثالثة من الإحداثيات الموضحة في الجدول 1. بعد الحقنة الأخيرة، قم بإزالة الماصة ووضع كمية كافية من شمع العظام لسد موقع ثقب الجمجمة. وأخيرًا، قم بتقريب حواف جرح فروة الرأس، وثبّتها باستخدام لاصق جلدي.

بعد إعطاء المسكنات بعد الجراحة، ضع الحيوان في قفص نظيف. قم بتوفير المضادات الحيوية بعد الجراحة في مياه الشرب لمدة خمسة أيام، أو حتى يتم التضحية بالحيوان إذا كانت المدة أقل من خمسة أيام. بعد التضحية بالفأر وفصل الرأس وفقاً للإجراءات المعتمدة، استخدم مقصاً معقماً لفتح الجمجمة من الخلف، ثم استخدم ملعقة مسطحة (spatula) لإزالة عظام الجمجمة العلوية برفق.

بعد ذلك، أدخل ملعقة معقمة بمقاس 4 مليمتر عند مقدمة الدماغ لقطع البصلة الشمية والأعصاب البصرية. ثم، ارفع الدماغ برفق من القحف وضعه في محلول تشريح منظم مبرد بالثلج. باستخدام كتلة تثبيت الدماغ وشفرات حلاقة معقمة، قم بقطع شرائح بسمك 2 إلى 3 مليمتر تحتوي على المنطقة المصابة، وضعها في محلول التشريح المنظم المبرد.

باستخدام مجهر تشريحي، حدد المادة البيضاء الكامنة تحت القشرة الحركية في نصف الكرة المخية المحقون. وفي الفترات الزمنية المبكرة التي تلي السكتة الدماغية، يمكن أن يتيح حقن L-Nio ممزوجاً بأصباغ مختبرية شائعة، مثل fast green، التعرف البصري على مكان السكتة الدماغية. أما في الفترات الزمنية الأطول بعد السكتة الدماغية، فيمكن تحديد المنطقة بصرياً من خلال النخر البؤري وشحوب الميالين.

بمجرد تحديد المنطقة، استخدم مشرطاً لتشريح منطقة المادة البيضاء التي تحتوي على السكتة الدماغية بدقة. قم بإزالة القشرة العلوية والجسم المخطط السفلي، حسب الرغبة. كما هو موضح هنا، يُظهر الوسم المناعي الفلوري للخيوط العصبية، الموضح باللون الأحمر، درجة فقدان المحاور العصبية بعد سبعة أيام من السكتة الدماغية، باستخدام النهج الإنسي.

باستخدام نهج الزاوية الخلفية، يتم استهداف إصابة السكتة الدماغية في المادة البيضاء فوق البطين الجانبي مباشرةً، والتي تظهر تفاعلية ميكروية مكثفة، كما تم الكشف عنها عن طريق الوسم المناعي لـ IBA-1. ويكشف ماركران للخيوط المتوسطة في الخلايا النجمية، وهما vimentin الموضح باللون الأحمر، والبروتين الحمضي الليفي الدبقي الموضح باللون الأخضر، عن تغيرات في مورفولوجيا الخلايا النجمية في المادة البيضاء بعد السكتة الدماغية. ويسمح الحقن المشترك للديكستران الأمين الفلوري في وقت تحريض السكتة الدماغية بتحديد الخلايا العصبية الفردية ذات المحاور المتضررة بسبب السكتة الدماغية.

يحدث معظم الوسم في المحاور العصبية داخل عصبونات الطبقتين الخامسة والسادسة في القشور الحسية الحركية الأولية التي تعلو منطقة السكتة الدماغية. تمثل هذه الصورة الحالة بعد سبعة أيام من السكتة الدماغية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 45 دقيقة، إذا تم تطبيقها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إحداث سكتة دماغية بؤرية في المادة البيضاء لدى الفأر، وتحضير الدماغ لمجموعة متنوعة من عمليات المعالجة اللاحقة، وهو أمر مفيد للإجابة على أسئلة هامة في مجال السكتة الدماغية والإصلاح العصبي.