الليزر التقاط تسليخ مجهري من الإنسان البروستات الظهارة لتحليل الحمض النووي الريبي

الهدف العام من بروتوكول التشريح الدقيق لالتقاط الليزر هذا هو عزل الحمض النووي الريبي الكلي من التجمعات النقية لأنواع الخلايا الظهارية البروستاتا من أنسجة البروستاتا المجمدة غير المتجانسة لتحليلات التعبير الجيني في اتجاه المصب. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحليل عينات المرضى والإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث سرطان البروستاتا ، مثل كيفية اختلاف تعبير الحمض النووي الريبي في عينات الأنسجة الاصطناعية الظهارية الحميدة والمرضية ، أو في عينات التجارب السريرية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن التشريح الدقيق لالتقاط الليزر يتيح عزل الحمض النووي الريبي للمجموعات المتجانسة من الخلايا الظهارية أو الخلايا المشقوقة من أنسجة البروستاتا المجمدة.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة للحصول على RNA عالي الجودة لأنهم لا يعرفون الخطوات الحاسمة للحفاظ على الحمض النووي الريبي. شروط مجانية ابدأ بجمع جميع الكواشف والأدوات اللازمة للإجراء. بعد السماح لأنسجة البروستاتا المجمدة بالتوازن داخل ناظم البرد لمدة 30 دقيقة ، قم برش وسط التثبيت في الجزء السفلي من الكاسيت وقم بتركيب الأنسجة بسرعة باستخدام ملقط مبرد.

ضع الكاسيت في مبرد ناظم البرد لمدة خمس دقائق لضبط وسط التثبيت. بمجرد ضبطه ، قم بالرش المجمد ، وتركيب الوسط على الظرف واضغط بعناية على الأنسجة المركبة فيه. الجانب السفلي لأعلى.

اترك التحضير لمدة خمس دقائق. قبل وضع الظرف في الحامل ، قم بقفل المقبض في موضعه وأدخل شفرة جديدة على جهاز التبريد. بعد فتح المقبض ، قم بتقديم العينة بعناية حتى يتم الوصول إلى التعرض المطلوب للنسجة.

عندما تصبح جاهزا ، اضبط ناظم البرد على خمسة ميكرون وقم بقص قسم أو قسمين. ضع هذه الأقسام على شريحة زجاجية مشحونة لتلوين الهيماتين والإيوين. ضع الشريحة على الفور في البرد ، 100٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين.

بعد هذا الوقت ، قم بإزالة الشريحة واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة. توفر الشريحة الملطخة h و d تصورا أفضل للقوام النووي ويجب أن يستخدمها أخصائي علم الأمراض لتحديد مجالات الاهتمام. بعد ذلك ، ضع إطار قلم بدرجة حرارة الغرفة.

انزلق في داعم الإطار ، واضبط ناظم البرد على 10 ميكرون وقم بإنشاء أقسام. يمكن وضع قسم إلى أربعة أقسام على كل شريحة ، اعتمادا على حجم الأنسجة. اغمر الشريحة على الفور في الإيثانول البارد بنسبة 100٪.

قم بإزالة الشريحة بعد دقيقتين واحفظها في الفريزر لتحليلها لاحقا. في نفس يوم التشريح الدقيق لالتقاط الليزر ، استرجع شرائح إطار القلم من الفريزر الذي يعمل في منطقة خالية من الحمض النووي الريبي. رطب الشرائح عن طريق غمسها برفق في 90٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين ، ثم 75٪ إيثانول لمدة دقيقتين.

بمجرد ترطيبها ، قم بتلطيخ أنسجة البروستاتا عن طريق غمس الشرائح برفق في اللون الأزرق 0.5٪ لمدة تتراوح بين خمس إلى 30 ثانية. احتجز الأنسجة عن طريق غسل الشرائح مرتين في ماء عميق لمدة 15 ثانية ، متبوعا بنسبة 75٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية إلى ثلاث دقائق. أخيرا ، انقل شرائح إطار القلم إلى حاوية جافة خالية من الحمض النووي الريبي على الجليد.

قبل البدء في الإجراء ، ضع شريحة حتى تجف على جهاز تسخين الشرائح لمدة 15 دقيقة. جفف فقط الشريحة التي ستتم معالجتها وقم بتخزين الباقي على الثلج لحين الحاجة. قم بتشغيل مكونات المضاعف المشترك الأصغر بالترتيب التالي.

قوة المجهر ، مفتاح الليزر ، مفتاح الليزر ، ثم الكمبيوتر. بعد ذلك ، قم بتشغيل برنامج التشريح الدقيق بالليزر باستخدام البرنامج. اطلب من المجهر تحميل الشرائح وأنابيب التجميع.

انقر فوق تفريغ حامل العينة وقم بتحميل الشريحة على حامل الشريحة بحيث يكون المنديل متجها لأسفل. أدخل حامل الشريحة في الفتحة المناسبة في المجهر وانقر فوق متابعة. بعد ذلك ، انقر فوق تفريغ أنابيب التجميع.

قم بتسمية الأنابيب وتحميلها على حامل الأنبوب وإدخالها في الفتحة المناسبة. قم بتأمين الأغطية وإضافة 35 ميكرولتر من محلول التحلل. الحرص على تجنب الفقاعات.

بمجرد تحميل أحرف التجميع الكبيرة، انقر فوق موافق. استخدم البرنامج لتحديد موضع الشريحة في الحامل ، ثم حدد غطاء التجميع لتجميع العينة. تصور الشريحة وتركيزها عبر الكمبيوتر بتكبير 10 ×.

استخدم البرنامج لمعايرة الليزر عن طريق اختيار الليزر. ثم قم بالمعايرة واضبط فتحة الطاقة وسرعة الليزر عن طريق تحديد الليزر ، ثم التحكم. استمر في إجراء التعديلات حتى يقطع الليزر الأنسجة بالكامل.

من الأهمية بمكان تحديد مجالات الاهتمام التي يقوم بها عادة أخصائي علم الأمراض المعتمد من مجلس الإدارة من أجل تشريح المناطق المرغوبة في الأنسجة المعرضة لل LCM بدقة باستخدام ترميز أخصائي علم الأمراض ثمانية × 11 ساعة و e كدليل مرئي. استخدم أداة رسم الشكل في البرنامج لتحديد المناطق المرغوبة من الظهارة في العرض وتجنب جمع أي سدى. انقر فوق القطع لبدء الليزر.

إذا لم يتم قطع منطقة بالكامل ، فاستخدم أداة النقل والقطع لتجاوزها يدويا. استمر في نقل الهدف إلى طرق عرض جديدة وكرر القطع بالليزر حتى يتم تشريح الشريحة بالكامل أو يتم جمع الكمية المطلوبة من الأنسجة. عند الانتهاء ، قم بإزالة الأنابيب بعناية من حامل التجميع وأغلق الأغطية مع مراعاة التحلل والمخزن المؤقت والأنسجة الموجودة في الأغطية.

باختصار ، جهاز طرد مركزي لمدة 30 ثانية لجمع السائل والأنسجة في قاع الأنبوب. احتضان العينات عند 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وتخزينها على حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة لعزل الحمض النووي الريبي. تظهر هذه الأمثلة أقسام البروستاتا الملونة باللون الأزرق التمثيلي على شريحة إطار القلم قبل وبعد التقاط الليزر لعناصر تحكم محددة من نوع خلية الظهارة الحميدة.

تأكد من خصوصية المنطقة الملتقطة بالليزر من الأنسجة. ظهارة حميدة والسدى. لا تعبر عن الجين المحدد لسرطان البروستاتا، A-M-A-C-R.

لم تعبر السدى عن الجين الظهاري المحدد و KX 3.1 أثناء محاولة هذا الإجراء. من المهم أن تتذكر العمل في بيئة خالية من الحمض النووي الريبي لمنع تدهور الحمض النووي الريبي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الحمض النووي الريبي عن التجمعات المتجانسة للخلايا الظهارية أو العاصفة من الأنسجة المجمدة للعديد من تقنيات التحليل النهائي.

لا تنس أن العمل باستخدام ناظم التبريد يمكن أن يكون خطيرا للغاية في الاحتياطات ، مثل التدريب الجيد والاهتمام الجيد للغاية بالشفرة يجب دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.