خلية الفحص مجاني لدراسة لونين Decondensation في نهاية الانقسام

الهدف العام من هذه التجربة هو إعادة تكوين الكروماتين بأمانة كما يحدث في نهاية الانقسام في بساطة الفحص الخالي من الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات أبحاث الانقسام لأنها تمكن من توصيف الآلية الجزيئية للكروماتين ، وإنهاء الاستعمار ، وتحديد العامل المتضمن في التنظيم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن التلاعب بها كيميائيا حيويا والكروماتين بسهولة.

يمكن دراسة إنهاء الاستعمار بمعزل عن أحداث دورة الخلية الأخرى. للبدء ، عزل مجموعات الكروماتين الانقسامي من خلايا الهليكوبتر وإعداد المخازن المؤقتة لتحضير مستخلص بيض IIC xenopus lavis كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. بمجرد التحضير ، استخدم حقنة سعة خمسة ملليلتر مزودة بإبرة قياس 27 لحقن 500 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية في الضفادع الناجمة عن الإباضة.

حقن الضفادع تحت جلد الكيس الليمفاوي الظهري في المساء السابق للتجربة للحث على إطلاق البويضات بمجرد إحداث ذلك ، احتفظ بالضفادع عند 18 درجة مئوية لمدة 13 إلى 17 ساعة في خزانات فردية تحتوي على 1.2 لتر من المخزن المؤقت المعدل للعلامة. بعد أن تضع الضفادع بيضها ، قم بإزالة البيض الذي تم تنشيطه بالفعل مع أي بيض سيئ المظهر. اجمعها عن طريق سكب الخزانات في أكواب زجاجية من 600 إلى 1000 مل بشكل صحيح.

يعد فرز البيض أمرا بالغ الأهمية لأن الجودة الإضافية الإجمالية تعتمد على الخطوة. قم بإزالة البيض الخيطي المنشط والسيئ المظهر. أيضا في الخطوات اللاحقة ، استمر في إزالة البيض الفاسد.

صب المادة الطافية S بمجرد أن يستقر البيض ، ثم أعد ملء الدورق بمحلول عازل طازج بعد ذلك. كرر هذه العملية أربع مرات لغسل البيض بعد الغسيل الأخير. قم بإزالة السوبينات مرة أخرى ثم املأ الدورق بمحلول 2٪ L من السيستين لتحديد البيض.

بعد دقيقتين إلى أربع دقائق ، قم بالتغيير إلى مخزن مؤقت جديد يحتوي على L cysteine. ضع في اعتبارك اكتمال التبلور عندما ينخفض حجم البيض بشكل كبير ويصبح البيض أكثر كثافة بعد حوالي خمس إلى سبع دقائق. بعد ذلك ، اغسل البيض بعناية في المخزن المؤقت المعدل للعلامة عن طريق صب وإعادة تعبئة المخزن المؤقت على جدار الدورق بدلا من البيض مباشرة.

ثم قم بتنشيط البيض في 100 مل من المخزن المؤقت المعدل لماركس الذي يحتوي على ثمانية ميكرولترات من ملليغرامين لكل ملليلتر. أيون الكالسيوم. رابعا ، أوقف التنشيط عندما يصبح تقلص غطاء مرئيا.

أو بعد 10 دقائق من التنشيط ، اغسل البيض بعناية في جرس مارك المعدل ، وقم بتخزينه عن طريق صب المخزن المؤقت وإعادة تعبئته بعد الغسيل الأخير. احتضن البيض في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في مخزن جرس مارك المعدل. بعد ذلك ، قم بإعداد خمسة ملليلتر من أنابيب الطرد المركزي مع 50 ميكرولتر من السكروز العازل ، و 50 ميكرولتر من مثبط البروتياز 100 أضعاف.

امزج خمسة ميكرولترات من DTT دولي واحد ، 12.5 ميكرولتر من cyclo heide ، و 2.5 ميكرولتر من الخلوي. ب- اغسل البيض مرتين باستخدام عازلة السكروز الباردة ، ثم انقلها إلى أنابيب الطرد المركزي. باستخدام ماصة المراعي البلاستيكية ذات الفتحة العريضة ، قم بتدوير الأنابيب لمدة دقيقة واحدة عند 130 جم ، بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد باستخدام ماصة مراعي بلاستيكية واملأ الغرفة الإضافية بمزيد من البيض.

ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب المملوءة بالبيض في دوار متأرجح ستة × خمسة مليلتر لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية و 21 ، 000 مرة جرام. مع فصل المحلول الآن إلى ثلاث طبقات ، ادفع حقنة سعة خمسة ملليلتر بإبرة قياس 16 عبر جانب الأنبوب وإلى الطبقة الوسطى بين صفار البيض الأصفر في الأعلى وفوق بقايا البيض المكسور الداكن في الأسفل. انقل المستخلص الطوري منخفض السرعة إلى أنبوب جديد على الثلج ، ثم أضف 10 ميكرولتر من مثبط البروتياز 100 ضعف.

امزج ميكرولتر واحد من مولر DTT واحد 2.5 ميكرولتر من cyclo heide بمعدل 20 ملليغرام لكل مليلتر ، و 0.5 ميكرولتر من cyto B.أضف 10 ملليغرام لكل مليلتر لكل مليلتر من المستخلص منخفض السرعة. قم بتدوير المستخلص الطوري منخفض السرعة لمدة 12 دقيقة عند 355 ، 000 مرة G في دوار 10 × ملليلتر. ثم قم بإزالة طبقة الدهون برفق في الأعلى وانقل الطبقة التي تحتوي على مستخلص عالي السرعة إلى أنبوب جديد.

هذه الخطوة ضرورية لإنتاج عينة عالية الجودة. احرص على أن السائل الذي تمت إزالته لا يحتوي على ملوثات من طبقة الدهون في الأعلى أو الطبقة السفلية المزعجة. ماصة 18 ميكرولترا من المستخلص عالي السرعة في أنبوب تفاعل 1.5 ملليلتر ، ثم أضف 0.5 ميكرولتر من الجليكوجين 0.5 ميكرولتر من مزيج الطاقة.

النقطة الثالثة ، ميكرولتر من ستة ثنائي ميثيل بيورين ، و 0.7 ميكرولتر من العناقيد الانقسامية. استخدم الأطراف ذات الفتحة الواسعة لخلط التفاعل بمجرد إضافة الكروماتين لمنع قص الكروماتين المزيل للتعويض. بمجرد الخلط ، احتضن خليط التفاعل لمدة تصل إلى ساعتين عند 20 درجة مئوية.

ثم قم بإصلاح العينة بإضافة 0.5 مل من المثبت المثلج البارد الذي يحتوي على 4٪ بارالديهايد و 0.5٪ جلوتارالديهايد و 0.1 ملليغرام لكل مليلتر نقطة في البوصة. باستخدام نصائح ذات فتحة واسعة ، احتضان العينة على الجليد لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد ذلك ، ينزلق الغطاء الدائري المكون من 12 ملم مع محلول بولي ليسين من الوزن بنسبة 0.1٪ إلى الحجم واحتضان زلات الغطاء لمدة خمس دقائق لزيادة تقارب زلات الغطاء.

لتجفيف الكروماتين ، ينزلق الغطاء على ورق الترشيح بعد ذلك. بمجرد أن يجف ، أضف زلات الغطاء المطلي إلى الجزء السفلي من أنابيب الطرد المركزي ذات القاع المسطح بسعة ستة مليلتر بحيث يكون الجانب المطلي لأعلى. ثم أضف 800 ميكرولتر من وسادة السكروز بنسبة 30٪ وقم بوضع طبقة من العينة الثابتة بالكامل في الأعلى.

قم بتدوير العينة لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية و 2 ، 500 مرة جم ، ثم قم بإزالة المادة الطافية S وإزالة زلات الغطاء من الأنابيب عن طريق الوخز بعناية في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي بإبرة قياس 16. عندما يتم رفع زلة الغطاء بواسطة الإبرة على جانب واحد ، استخدم ملاقط لإزالة زلة الغطاء ، واغسل زلة الغطاء بسرعة عن طريق غمسها في ماء منزوع الأيونات ، ثم جففها برفق عن طريق لمس جانبه لورق الترشيح. بعد ذلك ، ضع قطرة من وسائط التثبيت على شريحة مجهرية وقم بخفض جانب العينة من الغطاء.

انزلق على وسائط التثبيت. جفف الغطاء برفق باستخدام ورقة مسح ، وختم حول حافة زلة الغطاء بطلاء الأظافر ، واحتفظ بالشريحة في الظلام حتى يتم تصويرها. فيما يلي المسار الزمني النموذجي لمقايسة إلغاء التعويض.

مجموعة الكروموسومات المرئية في بداية التفاعل ، تتكاثف وتتكثف وتندمج في نواة واحدة مستديرة وناعمة. عندما يتم استبدال مستخلص البيض بمخزن مؤقت من السكروز ، تظل مجموعة الكروموسوم مكثفة ، مما يشير إلى وجود نشاط عدم التعويض في مستخلص البيض. في التجربة الموضحة هنا ، تمت إضافة نظائر A TP أو GTP غير المتحللة إلى التفاعل.

تمنع كل من هذه المواد المضافة التكثيف مما يثبت أن هذه العملية النشطة تعتمد على التحلل المائي ل A TP و GTP. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين تقريبا لإعداد مستخلص البيض في سنغافورة ، وثلاث ساعات لتعزيز اختبار الاستعمار. أثناء محاولة هذا الإجراء, من المهم أن نتذكر أن النجاح يعتمد بشكل حاسم على جودة استخراج.

خاصة بالنسبة للاستنفاد المناعي ، يوصى باستخدام مستخلص طازج بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل استنفاد المناعة وإضافة البروتينات المؤتلفة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل العوامل المعنية. ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات الانقسام أو التركيب النووي والوظيفة لاستكشاف تجريد الكروماتين من إنسانيته كما يحدث في نهاية الانقسام في الخلايا الحيوانية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير مستخلصات بيض الكبد ex xenopus وكيفية تطبيق الطريقة لإعادة تكوين إنهاء استعمار الكروماتين. لا تنس أن العمل مع Paraform Hyde و Hyde و DARPA يمكن أن يكون خطيرا ، ويجب اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء القفازات.