تعظيم الاستفادة من الفحص الجرح خدش للكشف عن تغيرات في الفئران الوسيطة اللحمية الهجرة الخلية بعد الأضرار التي كتبها القابلة للذوبان استخراج دخان السجائر

الهدف العام من هذا الاختبار هو الكشف عن التغيرات في القدرة على هجرة الخلايا اللحمية الوسيطة الرئوية بعد التلف بمستخلص دخان السجائر القابل للذوبان. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا تجديد الرئة ، بما في ذلك كيفية تحسين القدرة على هجرة الخلايا السلفية للرئة للمساعدة في إصلاح الرئة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه تم تحسينها لتوفير قياسات كمية أفضل لهجرة الخلايا مع الحفاظ على اقتصادية في الأداء وسهولة تخصيصنا.

في هذا العرض التوضيحي ، سيتم استخدام مقايسة الخدش لتحديد القدرة على الهجرة للخلايا اللحمية الوسيطة في رئة الفئران ، أو الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية الجذعية بعد التعرض لمستخلص دخان السجائر القابل للذوبان ، تزرع الخلايا الجذعية الجذعية في وسائط كاملة على ألواح 60 ملم وتتلف كما هو موضح في نص البروتوكول. يعد التقاء مناسب مهما لمقايسة الخدش لأنه يضمن أن برنامج التصوير يمكنه تحديد حدود الخدش بشكل صحيح.

يوضح هذا المثال MSCs عند التقاء 95٪ مناسبة للخدش في بيئة معقمة. قم بإزالة الغطاء من صفيحة من الخلايا الجذعية الجذعية التالفة وضع حافة مستقيمة ، مثل مسطرة بلاستيكية معقمة عبر الحافة العلوية للوحة. تقلل الحافة المستقيمة من مقدار التعديلات الدورانية اللازمة للوحة عند وضعها لاحقا على مرحلة المجهر للتصوير.

بدون إزالة الوسائط، استخدم طرف ماصة معقم سعة 200 ميكرولتر مسترشد بالحافة المستقيمة المعقمة لعمل أربعة خدوش متوازية عبر اللوحة، على بعد خمسة ملليمترات تقريبا وطولها 50 ملم. لا يؤدي إنشاء خدوش متعددة على لوحة 60 ملم إلى تغيير البيئة المكروية بطريقة تؤثر على هجرة الخلايا للخلايا للخلايا الجذعية الوسيطة ، ولكنها قد تكون اعتبارا لأنواع الخلايا الأخرى. استنشق الوسائط واغسل الطبق برفق بملليلترين من الوسائط الكاملة الدافئة.

هذا يمنع الخلايا من الالتصاق بمركز الخدش ويزيل الخلايا التي تم فكها بسبب الخدش. استبدل بأربعة ملليلتر من الوسائط الكاملة الطازجة باستخدام ملصق قلم تحديد معقم ودائم كل خدش من واحد إلى أربعة على الجانب السفلي من اللوحة في المواقع التي لن تتداخل مع التصوير. يجب التقاط الصور الأولية للخدوش لكل خدش لأنه من المهم مقارنة الصور من نفس نقطة الصفر قبل الترحيل وبعده ، حيث يمكن أن يكون هناك اختلاف في عرض الخدود.

إذا تم إجراء فحص الخدش على لوحات متعددة ، فمن المستحسن التقاط صور أولية لجميع الخدوش على لوحة واحدة قبل إجراء الخدوش على اللوحة التالية. استخدم مجهر تباين الطور المقلوب مع كاميرا للحصول على الصور اللازمة للتحليل. ضع لوحة الثقافة على المجهر واستخدم هدف الطاقة المنخفضة لتحديد موقع الخدش.

رقم واحد. من الضروري أن يظهر الخدش أفقيا تماما على الشاشة مع الحفاظ على الخدش أفقيا تماما وفي وسط مجال الرؤية ، واحصل على أكبر عدد ممكن من الصور لتشمل 90٪ من طول الخدش. احصل على صور من أجزاء مميزة من نقطة الصفر دون تداخل بين الصور.

لا تلتقط صورا من أول وآخر 5٪ من طول الخدش لأن انكسار الضوء عند حواف طبق الثقافة يكشف الصور ، مما يجعل من المستحيل تحليلها. احفظ الصور من البداية ، رقم واحد في مجلد. احصل على صور للخدوش الثانية والثالثة والرابعة بنفس الطريقة ، واحفظ الصور من كل خدش في مجلد منفصل.

أعد الألواح إلى الحاضنة مباشرة بعد هذا التصوير الأولي. دع الخلايا تهاجر لمدة أربع إلى سبع ساعات قبل بدء هذا الفحص. قم بتنزيل برنامج Image J وقم بتثبيت المكون الإضافي لأداة التئام الجروح.

افتح ملف الصورة في الصورة J ، ثم انقر فوق معالجة وابحث عن الحواف لتمييز الخلايا المحيطة بالخدش لأداة التئام الجروح. لحساب منطقة التسويد، انقر فوق ضبط الصورة وعتبة اللون، وفي القائمة المنسدلة المسماة لون العتبة، قم بتغيير القيمة إلى BNW داخل قائمة عتبة اللون. حرك شريط التمرير السفلي بالكامل إلى اليمين لجعل الصورة سوداء تماما ، ثم اضبط شريط التمرير العلوي لتوليد أقصى قدر من التباين بين الخدش ومقدمة الخلية.

اضبط شريط تمرير السطوع العلوي ببطء من اليسار إلى اليمين حتى تعرض الصورة محيط الخدش بشكل نظيف. بمجرد تحديد حواف الخدش ، انقر فوق المزيد من الأدوات. في شريط أدوات الصورة J ، حدد أداة التئام الجروح بالرنين المغناطيسي من القائمة المنسدلة واضغط على الزر M لتمييز منطقة الخدش وإخراج المنطقة المحسوبة.

في نافذة منبثقة للنتائج، انسخ جميع الأرقام والصقها من نافذة النتائج في جدول بيانات Excel. تأكد من فصل البيانات عن الخدوش الفردية. بعد ترحيل الخلايا لمدة أربع إلى سبع ساعات ، كرر إجراء الحصول على الصور لصور الخدوش اللوحات بنفس الترتيب الذي تم خدشها فيه بحيث يكون للخلايا الموجودة على كل لوحة وقت متساو للهجرة.

يمكن تصوير الخلايا في نقاط زمنية متعددة اعتمادا على حساسيتها لكل من تغيرات درجة الحرارة ودرجة الحموضة. ثم يتم تحليل صور الخدش النهائية باستخدام الصورة J بنفس الطريقة الموضحة لصور الخدش الأولية. يمكن أيضا حساب مناطق الخدش لتحديد الهجرة ، بشكل صحيح.

التقاء أمر بالغ الأهمية لنجاح اختبار الخدش. يظهر هنا خدش ناجح للخلايا الجذعية الجذعية في رئة الفئران عند التقاء 95٪. في المقابل ، فإن التقاء 70٪ منخفض جدا بالنسبة للخدش الناجح ويمكن أن ينتج عنه حدود خاطئة.

هذه هي الصور الأصلية التمثيلية قبل الترحيل وما بعد الترحيل مع حدود منطقة الخدش المقابلة كما هو محدد بواسطة برنامج التصوير. توضح هذه الرسوم البيانية متوسط مساحة الخدش المحسوبة بالبكسل لكل من الخدوش الأربعة التي تم إجراؤها عبر صفيحة من الخلايا الجذعية الجذعية لرئة الفئران عند التقاء 95٪ إما قبل أو بعد الهجرة مع التعرض لمستخلص دخان السجائر بنسبة 0٪ أو 4٪. كشفت مقارنة متوسط التغيير المحسوب في منطقة الخدش عن تقليص هجرة الخلايا الجذعية الجذعية للرئة الفئرانية بعد التعرض لمستخلص دخان السجائر بنسبة 4٪.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحسين ومراقبة التقاء الخلايا بعناية لنوع الخلية المعين الذي كنا نعمل معه والتدرب على توليد الخدوش للتأكد من أنها موحدة قدر الإمكان. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تقنيات أخرى مثل الكيمياء المناعية للإجابة على أسئلة إضافية حول التغيرات والتعبير عن البروتين التي قد تؤثر على هجرة الخلايا.