استخراج متتابعة من القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان ألفا Synuclein من أدمغة الشلل الارتعاشي

الهدف العام من هذه المنهجية هو استخراج ألفا سينوكلين القابل للذوبان وغير القابل للذوبان من أدمغة باركنسون بعد الوفاة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسة مرض باركنسون. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تقنية مباشرة نسبيا باستخدام الكواشف والأدوات المختبرية الشائعة.

بعد تحضير المحاليل والمخازن المؤقتة اللازمة ، ابدأ بوضع عينة 0.5 جرام من أنسجة العقد القاعدية المجمدة على طبق بتري صغير. استخدم شفرة مشرط معقمة لفرم بسرعة إلى أجزاء مربعة بحجم ملليمتر واحد. اجمع الأنسجة المفرومة في أنبوب سعة 15 مليلتر ، وأضف 10 كميات من الثلج البارد ، 1X TBS إلى الأنبوب.

قم بتجانس العينات باستخدام الخالط الميكانيكي عند 20 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان. ثم تبرد على الثلج لمدة دقيقتين. كرر التجانس ثلاث مرات ، وقم بتبريده على الجليد في كل مرة.

جهاز الطرد المركزي المتجانس عند 10 ، 000 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. نقل المادة الطافية المتجانسة الخام إلى أنابيب الطرد المركزي المصنوعة من البولي كربونات ، وأجهزة الطرد المركزي عند 100 ، 000 جم لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الطافية إلى أنابيب مبردة على الجليد ، واحتفظ بها باعتباره الجزء القابل للذوبان TBS.

اغسل في خمسة أحجام من المخزن المؤقت 1X TBS ، وجهاز الطرد المركزي عند 100 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. استنشق وتخلص من المادة الطافية. ثم كرر الغسيل.

الغسيل الشامل للكريات بين خطوات الطرد المركزي الفائق أمرا بالغ الأهمية لنجاح هذا الإجراء. بعد السماح للعينات بالوصول إلى درجة حرارة 10 درجات مئوية لتجنب هطول الأمطار SDS ، أضف خمسة أحجام من 1X TBS-SDS وأعد تعليق الحبيبات النهائية عن طريق صوتنة لمدة 10 ثوان عند 20 كيلو هرتز في درجة حرارة الغرفة. جهاز طرد مركزي فائق عند 100 ، 000 جم لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية.

بعد الطرد المركزي الفائق ، انقل المادة الطافية إلى أنابيب مبردة على الجليد ، واحتفظ بها باعتباره الجزء القابل للذوبان SDS. أضف خمسة أحجام من المخزن المؤقت لدرجة حرارة الغرفة 1X TBS-SDS إلى الحبيبات ، وجهاز الطرد المركزي عند 100 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية. تخلص من مخزن الغسيل وكرر الغسيل.

بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف 50 ميكرولترا من 1X TBS-SDS-Urea وقم بالذوبان باستخدام مكبر صوتي على 20 كيلو هرتز لمدة 10 ثوان. قم بتسمية هذه العينة على أنها جزء قابل للذوبان في اليوريا. من الضروري التأكد تماما من استخراج جميع البروتينات غير القابلة للذوبان في الإجراء.

بتخفيف عينات TBS-SDS-Urea بشكل فردي باستخدام 1X TBS المؤقت للسماح بالتوافق مع كواشف فحص البروتين ، وفحص كل جزء لمحتوى البروتين الكلي باستخدام مجموعة فحص البروتين التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قم بتقطيع العينات إلى 20 ميكرولتر مع 10٪ جلسرين لتقليل دورات التجميد والذوبان المستقبلية ، وتخزينها عند سالب 80 درجة مئوية. قم بتحميل 10 ميكرولترات من مستخلصات TBS و TBS-SDS و TBS-SDS-Urea في علامة الوزن الجزيئي على 10 بئر ، من أربعة إلى 12 بالمائة من هلام بولي أكريلاميد Bis-Tris مع MOPS كمخزن مؤقت للتشغيل باستخدام التقنيات القياسية.

قم بتشغيل الجل على حرارة 200 فولت لمدة ساعة واحدة ، أو حتى تصل الصبغة الزرقاء من مخزن التحميل إلى قاع الجل. بلل غشاء نايلون في 100٪ ميثانول ، ثم انقعه في مخزن مؤقت يحتوي على 20٪ من الميثانول. ضع علامة تعريف على اللطخة لتحديد جانب البروتين واتجاه علامات حجم الوزن الجزيئي.

شطيرة الجل مع الغشاء جنبا إلى جنب مع ورق الترشيح المبلل. قم بإجراء النقل لمدة ساعتين عند 40 فولت. قم بحظر محلول BSA بنسبة 5٪ في 1X PBS-T لمدة 30 دقيقة مع الاهتزاز عند 70 دورة في الدقيقة لمنع الارتباط غير المحدد للجسم المضاد الأساسي بالغشاء.

قم بفحص لطخة البروتين عن طريق الحضانة بستة ملليلتر من الجسم المضاد الأساسي ألفا سينوكلين Syn-1 المخفف من واحد إلى 750 في PBS-T بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الغشاء باستخدام 1X PBS-T ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة. ثم احتضان اللطخة بالجسم المضاد الثانوي المترافق HRP المناسب المخفف من واحد إلى 2 ، 000 في PBS-T لمدة 30 دقيقة.

اغسل الغشاء كما كان من قبل باستخدام 1X PBS-T. اغمر البقع في محلول التلألؤ الكيميائي المحسن وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في غرفة مظلمة. قم بتغطية البقع بغشاء ملتصق ، والتقط الإشارة باستخدام التصوير الشعاعي الذاتي.

بعد التصوير ، احتضان اللطخة الغربية بستة ملليلتر من المخزن المؤقت لتجريد اللطخة الغربية لمدة 10 دقائق مع اهتزاز مستمر لتجريد اللطخة من إشارة الجسم المضاد ألفا سينوكلين. كرر إجراء اللطخة الغربية لفحص الغشاء بالجسم المضاد الأولي بيتا أكتين عند تخفيف من واحد إلى 8,000. مسح الصورة النهائية وتحويلها إلى صورة Tiff وقياس الكثافات باستخدام NIH ImageJ لأغراض القياس الكمي.

الصور التالية هي بقع مناعية تمثيلية لمستويات ألفا سينوكلين من مرض باركنسون وتتحكم في أنسجة العقد القاعدية البشرية. تم تحليل الكسور القابلة للذوبان TBS و SDS واليوريا لوجود ألفا سينوكلين باستخدام اللطخة المناعية الغربية. تم تحميل 10 ملليغرام من البروتين في كل حارة.

في جزء TBS ، توجد مونومرات ألفا سينوكلين في جميع الحالات. من المحتمل أن تمثل العلامة النجمية شكلا مقطوعا بشكل C من ألفا سينوكلين. في جزء SDS ، تظهر بعض قلات أوليغومرات ألفا سينوكلين جنبا إلى جنب مع المونومرات ، المشار إليها برأس السهم الصلب في أنسجة PD.

في جزء اليوريا ، يتم التعبير عن المونومرات والقلات وألفا سينوكلين المجمعة بشكل متغير في حالات مرض باركنسون ، مما يعكس حمل جسم ليوي الخاص بها. تظهر عينات التحكم الطبيعية العصبية وجود كميات صغيرة فقط من ألفا سينوكلين أحادي. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنية استخراج البروتين هذه في غضون يوم عمل ، تليها اللطخة المناعية الغربية في اليوم التالي ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا أجسام ليوي لاستكشاف أنواع ألفا سينوكلين غير القابلة للذوبان والمجمعة في الأنسجة البشرية المرضية وفي النماذج الحيوانية في الجسم الحي. لا تنس أن العمل مع الأنسجة البشرية غير المثبتة يتطلب تدابير احترازية ، ويجب ارتداء القفازات ومعاطف المختبر طوال الوقت لجميع إجراءات المناولة.