توصيف الأيض من الاستقطاب M1 M2 الضامة والعظام نخاع المستمدة من طريق في الوقت الحقيقي التحليل خارج الخلية الجريان

العام من تحليل التدفق خارج الخلية هذا هو تقييم الخصائص الأيضية ل M1 و M الساذجة اثنين من الضامة المستقطبة المشتقة من نخاع العظم. يمكن أن تكون هذه الطريقة بمثابة إطار عمل للتحقيق في كيفية تأثير السيتوكينات أو المركبات أو الرموز الجينومية المعينة على النمط الظاهري الأيضي للضامة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب سوى كمية صغيرة من البلاعم.

علاوة على ذلك ، فإنه يقيس جميع معلمات تحلل السكر والميتوكوندريا ذات الصلة في اختبار واحد. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر نظرة ثاقبة للنمط الظاهري الأيضي للبلاعم المشتقة من نخاع العظام ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على جميع أنواع البلاعم أو الخلايا المناعية. كانت لدينا فكرة نشر هذه الطريقة في J لأننا نتلقى بشكل متكرر طلبات من علماء آخرين لمساعدتهم في فحوصات التدفق الخلوي للوصول الأيضي في اليوم الثامن من الثقافة ، تحقق من وجود البلاعم الناضجة عن طريق الفحص البصري واحتضان الضامة المشتقة من نخاع العظم الناضج في 10 ملليلتر من محلول السترات الملحي لمدة خمس دقائق.

أ 37 درجة مئوية عندما تنفصل الخلايا. اغسل المزرعة ب 10 ملليلتر من PBS واحسب عدد الخلايا القابلة للحياة. ثم البذور خمسة في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر.

في مزرعة الخلايا XFE 96 ، صفيحة دقيقة في 100 ميكرولتر من وسط الاستزراع لكل بئر ، مع تثبيت الماصة بزاوية في منتصف الطريق تقريبا أسفل جانب كل بئر. لتوزيع الخلايا ، أضف الوسيط وحده إلى آبار تصحيح الخلفية A واحد و A 12 و H واحد و H 12. ثم اترك الخلايا تستقر في درجة حرارة الغرفة في غطاء مزرعة الخلية لمدة ساعة واحدة.

بعد التأكد من ثقافة الالتصاق ، الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد ثلاث ساعات من الطلاء ، قم بتحفيز ما بين أربعة إلى ستة آبار من الخلايا لكل حالة حسب الاقتضاء لمدة 24 ساعة. لاستقطاب البلاعم المشتقة من نخاع العظم في اليوم السابق لمقايسة التدفق خارج الخلية ، ضع خرطوشة المستشعر رأسا على عقب بجوار لوحة المرافق واملأ كل لوحة جيدا ب 200 ميكرولتر من محلول كرين.

بعد ذلك ، قم بخفض خرطوشة المستشعر على لوحة المرافق لغمر المستشعرات في محلول Cain والتحقق من أن مستوى محلول Cain مرتفع بما يكفي لإبقاء المستشعر مغمورا. ثم ضع الخرطوشة في حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بإزالة المادة الطافية برفق من البلاعم المستقطبة وغسل الخلايا ب 100 ميكرولتر من المقايسة المعدة حديثا.

متوسط لكل بئر. أضف 180 ميكرولترا من وسط الفحص إلى كل بئر ، واستخدم المجهر للتحقق من عدم غسل الخلايا. إذا كانت الخلايا لا تزال متصلة ، فضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية غير ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة قبل تشغيل الفحص أثناء احتضان الخلايا.

قم بإعداد 10 × خلطات مركب الحقن كما هو موضح في الجدول وقم بتسخين الخلطات إلى 37 درجة مئوية. ثم قم بتحميل خرطوشة المستشعر بالأحجام المناسبة من المركب والمنافذ A و B و C و D باستخدام أدلة التحميل المتوفرة لتوصيف الطاقة الحيوية للبلاعم المستقطبة عن طريق مقايسة التدفق خارج الخلية. استخدم معالج الفحص لإنشاء قالب فحص بمزيج دقيقتين وثلاث دقائق قياس مرات ، وثلاث حلقات قياس للخلط والمعدل على الأقل قبل كل من الحقن الأربعة وبعد الحقن الأخير.

ثم ابدأ الفحص واتبع التعليمات كما هو موضح في الجهاز. تحميل لوحة الخرطوشة بالمجسات الرطبة للسماح بالمعايرة بواسطة الجهاز ولوحة الخلية. عند التعليمات ، في نهاية الفحص ، تخلص بعناية من كل وسيط الفحص وقم بتخزين الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا التي تم تحليلها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى التطبيع.

لتطبيع الخلايا باستخدام مجموعة مقايسة تكاثر الخلايا ، قم بإذابة اللوحة واحتضان الخلايا في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا المحضر حديثا لكل بئر لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، قم بقياس التألق بحوالي 480 نانومتر من الإثارة وحوالي 520 نانومتر كحد أقصى. باستخدام قياسات التألق المكتسبة لحساب النسبة التي يتم فيها تعيين متوسط عدد الخلايا لجميع آبار البلاعم الساذجة عند واحد ، ثم قم بتصدير هذه النسب إلى برنامج تحليل موجات فرس البحر.

لتطبيع البيانات ، عادة ما ينتج عن مقايسة التدفق خارج الخلية معدل تحمض خارج الخلية أو ECAR ومعدل استهلاك الأكسجين ، أو مخططات التعرف الضوئي على الحروف كما هو موضح في هذا الشكل التمثيلي بعد حقن الجلوكوز ، تمثل الزيادة الملحوظة في ECAR معدل تحلل السكر. توفر الزيادة الإضافية التي لوحظت في ECAR بعد تثبيط TP synthase مع جميع liga mycin مزيدا من المعلومات حول احتياطي سكر السكر والسعة. عند تحليل قيم التعرف الضوئي على الحروف ، يسهل حقن CIN حساب استهلاك الأكسجين المستخدم في تخليق الميتوكوندريا A TP ، ويقوم FCCP بفصل تنفس الميتوكوندريا.

قياسات التعرف الضوئي على الحروف المقابلة بيانات حول تعفن القدرة التنفسية القصوى والاحتياطية المعروفة وحقن مضاد مايسين ، ومع ذلك ، فإن مجمعات الميتوكوندريا الأولى والثالثة مع تمثيل OCR المتبقي لاستهلاك الأكسجين غير الميتوكوندريا. يؤدي تنشيط البلاعم مع LPS إلى زيادة التمثيل الغذائي للسكر. مع الاختلافات بين LPS و IL ، أصبحت أربعة بلاعم معالجة أكثر وضوحا عند ملاحظة معدلات استهلاك الأكسجين.

في الواقع ، في حين أن التمثيل الغذائي التأكسدي الأقصى يتم قمعه بشكل كبير في البلاعم المعالجة LPS IL أربعة يحفز تنفسا قويا في M اثنين من الضامة. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال اختبار الإنفلونزا خارج الخلية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر حقن الطبيب البيطري مع FCCP لتغذية أقصى قدر من التنفس عند الفصل.

بعد هذه التقنية ، يمكن إجراء فحوصات إضافية مثل Eliza لتقييم استقطاب البلاعم الفعال. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين من مجال علم المناعة لاستكشاف الخصائص الأيضية لمجموعة واسعة من الخلايا المناعية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تحليل التدفق خارج الخلية لتقييم النمط الظاهري الأيضي للضامة.