تحسين توليد المستحثة العضلية باستخدام تعبيد متعدد المقارين تعرب عن النسبة المثلى من Gata4، Mef2c وTbx5
November 13th, 2015
نصف هنا بروتوكولا لتوليد iCMs باستخدام التسليم بوساطة الفيروسات القهقرية ل Gata4 و Tbx5 و Mef2c في بنية متعددة السترونيك. ينتج عن هذا البروتوكول مجموعة متجانسة نسبيا من الخلايا المعاد برمجتها مع تحسين الكفاءة والجودة وهو ذو قيمة للدراسات المستقبلية لإعادة برمجة iCM.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو توضيح كيفية توليد خلايا عضلة القلب المستحثة بكفاءة من الخلايا الليفية القلبية باستخدام بنية MGT متعددة السيونات ، معبرة عن النسبة المثلى من غاتا أربعة ، و F اثنين C ، و TBX خمسة. توفر هذه الطريقة منصة قيمة لأبحاث خلايا عضلة القلب المستحثة وستسهل الدراسات اللاحقة والدراسات الميكانيكية لبرمجة خلايا عضلة القلب المستحثة مع تحريك المجال أيضا نحو تطبيقات العيادة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه باستخدام بنية فيروسات قهقرية واحدة فقط ، يمكن تحويل الخلايا الليفية القلبية بكفاءة إلى خلايا عضلة القلب.
قم بتنظيف الفأر المعدل وراثيا GFP ذو السلسلة الثقيلة لحديثي الولادة بحجم 75٪. الإيثانول أداء القتل الرحيم. ثم افتح تجويف الجسم عن طريق عمل شق أفقي من تحت إبط إلى آخر باستخدام ملقط معقم وغير حاد ومنحني.
قم بتشريح القلب ووضعه في بئر واحد من صفيحة 24 بئر تحتوي على ثلج. يلاحظ برنامج تلفزيوني بارد تعبير GFP في جميع أنحاء القلب باستخدام الفحص المجهري الفلوري. ضع ثلاثة إلى 4G FP إيجابية في طبق ثقافة بئر مركزي 60 ملم باستخدام ملقط ومقص معقم ، وقم بفرم القلوب إلى قطع صغيرة أقل من ملليمتر مكعب واحد.
انقل القلوب المفرومة إلى طبق طوله 10 سم وقم بتغطيتها بملليلترين من الألياف أو وسط FB. اترك الأطباق دون إزعاج لمدة ثلاث ساعات على الأقل في حاضنة 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، أضف ببطء ثمانية ملليلتر من وسط FB الدافئ إلى الطبق الذي يحتوي على أنسجة القلب المفرومة.
ثم احتضان الأنسجة دون إزعاج باستثناء تغيير الوسط كل ثلاثة أيام. في اليوم السابع ، استنشق وسط المزرعة واغسل الخلايا باستخدام DPBS. أضف ثلاثة ملليلتر من 0.05٪ رحلات في EDTA إلى كل طبق واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
أضف خمسة ملليلتر من وسط FB لإلغاء تنشيط التربسين ، ثم افصل الخلايا برفق باستخدام مكشطة الخلية. بعد ذلك ، اجمع الخلايا وقم بالتصفية من خلال مصافي خلايا 40 ميكرون لتجنب التلوث بشظايا أنسجة القلب. حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق ، بدءا من قلوب الفئران حديثي الولادة المعزولة.
قطع كل قلب إلى أربع قطع لا تزال متصلة بشكل فضفاض. انقل القلوب إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر يحتوي على ثمانية ملليلتر من 0.05٪ تريبسين الدافئ في EDTA واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، تخلص من الرحلات في EDTA وأضف خمسة ملليلتر من دوامة الكولاجيناز الدافئة من النوع الثاني لمدة دقيقة واحدة بسرعة متوسطة ، ثم احتضان الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.
ثم دوامة الأنبوب مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة. اسمح لقطع الأنسجة بالاستقرار وجمع المادة الطافية في أنبوب جديد يحتوي على خمسة ملليلتر من وسط FB البارد. أضف خمسة ملليلتر من الكولاجيناز الطازج من النوع الثاني إلى قطع الأنسجة وكرر خطوات الدوامة والحضانة.
اجمع بين جميع الخلايا التي تحتوي على مواد طافية عن طريق تصفيتها من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون. الطرد المركزي لهذه الخلايا عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. اتباع أي من طريقتي عزل الخلايا الليفية القلبية.
اغسل حبيبات الخلية النهائية مرة واحدة في 10 ملليلتر من فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية أو الحد الأقصى للمخزن المؤقت. قم بإزالة 10 ميكرولتر لعد الخلايا الحية وقم بالطرد المركزي للخلايا المتبقية عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية لأقل من واحد في 10 إلى الخلايا السابعة. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 10 ميكرولتر من الفخذ 1.2 ميكروبيدات مغناطيسية مترافقة في 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت الأقصى المبرد واخلطه.
حسنا ، احتضان الخرزات عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. لتكسير الخلايا ، أضف 10 ملليلتر من الحد الأقصى للمخزن المؤقت وقم بالطرد المركزي للعينات عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق. اغسل مرة واحدة ب 10 ملليلتر من الحد الأقصى للمخزن المؤقت وأعد تعليق حبيبات الخلية بحجم إجمالي يبلغ ملليلترين في غطاء مزرعة الخلايا.
قم بإعداد فاصل الحد الأقصى وإضافة عمود LS. قم بموازنة العمود بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت الأقصى. مرر تعليق الخلية عبر عمود LS واغسله ثلاث مرات بملليلترين من المخزن المؤقت الأقصى.
ثم قم بإزالة عمود LS من الفاصل وقم بإزالته ثلاث مرات باستخدام ملليلترين من المخزن المؤقت الأقصى. جمع EIT في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. جهاز الطرد المركزي EIT عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق.
أعد تعليق الخلايا الليفية المعزولة في 10 ملليلتر من وسط FB وعد الخلايا ، وزرع الخلايا في أطباق زراعة الأنسجة بكثافات مناسبة في صفيحة جيلاتين 24 بئر مشفرة مسبقا لإعادة برمجة الخلايا الليفية القلبية. أضف 500 ميكرولتر من خلية عضلة القلب المستحثة أو وسيط ICM الذي يحتوي على بولي دماغ إلى كل بئر من 24 لوحة بئر مثبتة بالخلايا. أضف 10 ميكرولترات من الفيروس القهقري إلى كل بئر من الخلايا الليفية المعزولة.
احتضان اللوحة بجزيئات الفيروسات القهقرية لمدة 24 إلى 48 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا. ثم استبدل الوسط المحتوي على الفيروس ب 500 ميكرولتر من وسيط ICM الطازج ، مع تغيير الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام. ابدأ في الاختيار الإيجابي للخلايا المنقولة الفيروسية عن طريق استكمال وسيط ICM بميكروغرامين لكل مليلتر من الميسين النقي.
بعد ثلاثة أيام من الاختيار ، قم بتغيير الوسيط إلى جرعة مداومة تبلغ ميكروغرام واحد لكل مليلتر من الميسين لتصور تحويل الخلايا الليفية القلبية إلى خلايا عضلة القلب. راقب لوحات pur mycin المحددة للتعبير عن GFP باستخدام مجهر مقلوب. أخيرا، بعد 14 يوما من العلاج الفيروسي، يستعاض عن وسيط ICM ب B 27.
قد تظهر مواضع الخلايا النابضة العفوية المتوسطة في غضون ثلاثة إلى أربعة أسابيع بعد التعبير عن نقل الفيروس لعلامات القلب ، بما في ذلك تروبونين القلب t و alpha. يمكن اكتشاف الأكتينين عن طريق الكيمياء المناعية في الأيام من 10 إلى 14. هنا ، يظهر تعبير التروبونين القلبي T في I CMS المحول من الخلايا الليفية ، والتي تعبر عن تعبير ألفا أكتينين GFP في ICMs يمكن رؤيتها هنا.
يظهر التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي زيادات مماثلة في تعبير التروبونين القلبي T ، خاصة بعد اختيار المايسين النقي لخلايا عضلة القلب المستحثة. تسمح الأساطير الموضحة هنا بالتوليد الفعال لخلايا عضلة القلب المستحثة بناء على التوصيل الفيروسي الرجعي لعوامل نسخ NGT في بنية واحدة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
النظرة العامة
يحدد هذا البروتوكول عملية توليد خلايا عضلة القلب المستحثة (iCMs) من الخلايا الليفية القلبية باستخدام تركيبة متعددة الحمض النووي. تعزز الطريقة من كفاءة وجودة الخلايا المعاد برمجتها، مما يسهل الأبحاث المستقبلية في إعادة برمجة iCM.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا القلب والأوعية الدموية
- إعادة برمجة الخلايا
- أبحاث الخلايا الجذعية
الخلفية
- الخلايا العضلية القلبية المستحثة ضرورية لدراسات تجديد عضلة القلب.
- الطرق الحالية لتوليد iCMs غالباً ما تفتقر إلى الكفاءة.
- أنظمة التوصيل الرجعي الفيروسي يمكن أن تعزز إعادة البرمجة.
- استخدام تركيبة متعددة الحمض النووي يسمح بالتعبير المتزامن لعوامل النسخ الرئيسية.
هدف الدراسة
- لإظهار بروتوكول فعال لتوليد iCMs.
- لتحسين جودة وتوجانس الخلايا المعاد برمجتها.
- لتسهيل الدراسات الميكانيكية والتطبيقات السريرية لـ iCMs.
الطرق المستخدمة
- توصيل الرجعي الفيروسي لـ Gata4 وTbx5 وMef2c.
- استخدام تركيبة متعددة الحمض النووي لتعبير الجينات.
- عزل الخلايا الليفية القلبية من الفئران حديثي الولادة.
- تقييم كفاءة إعادة البرمجة وجودة الخلايا.
النتائج الرئيسية
- ينتج البروتوكول مجموعة متجانسة من iCMs.
- كفاءة محسنة في تحويل الخلايا الليفية إلى خلايا عضلة القلب.
- يسهل الفحص عالي الإنتاجية لـ iCMs.
- يدعم الدراسات الميكانيكية المستقبلية في بيولوجيا القلب.
الاستنتاجات
- تمثل هذه الطريقة تقدمًا كبيرًا في أبحاث iCM.
- توفر منصة قيّمة لمزيد من الدراسات في تجديد عضلة القلب.
- قد تؤدي المقاربة إلى تطبيقات سريرية محسنة في أمراض القلب.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Efficient generation of induced cardiomyocytes (iCMs) from cardiac fibroblasts addresses a key bottleneck in cardiac disease modeling and regenerative medicine. By optimizing transcription factor stoichiometry via a single polycistronic construct, this method improves reprogramming efficiency and cellular homogeneity, enabling more reliable mechanistic studies and preclinical screening. The approach supports target validation and lead identification efforts by providing a scalable, reproducible human-relevant disease model.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac reprogramming mechanisms and functional validation of transcription factor networks.
- Operational Value: Reduces variability in iCM generation, supporting consistent target engagement assays.
- Predictive Value: Improves confidence in phenotypic readouts by increasing the proportion of fully reprogrammed cardiomyocytes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a homogeneous iCM population for quantitative assessment of contractility, marker expression, and drug response.
- Operational Value: Enables high-throughput screening workflows due to improved efficiency and selection compatibility with puromycin.
- Assay Readiness: Supports standardized, reproducible generation of iCMs for downstream functional and imaging-based assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease modeling by enabling conversion of patient-derived fibroblasts into iCMs for genotype-phenotype correlation.
- Operational Value: Supports longitudinal studies through stable expression of cardiac markers like troponin T and alpha-actinin.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing a scalable source of iCMs for efficacy and toxicity profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in cardiovascular biology and enabling scalable production of iCMs for assay deployment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking of transcription factor combinations in cardiac reprogramming.
- Screening: Delivers assay-ready iCMs with quantifiable outputs such as troponin T expression and spontaneous beating.
- Analytics: Enables flow cytometry and immunochemistry-based quantification of reprogramming efficiency and maturation.
- Translational Research: Connects to preclinical applications by providing a renewable source of iCMs for drug testing and mechanism of action studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iCM generation across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cardiac phenotypes by reducing incomplete reprogramming.
- Operational Value: Standardizes iCM production through a single-vector system, simplifying workflow and reducing variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by enhancing the reliability of iCM-based assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiac targets through more accurate disease modeling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac fibroblast isolation, retroviral transduction, and flow cytometry.
- Depends on retroviral production infrastructure and biosafety level 2 compliance.
- Necessitates standardized culture conditions including gelatin-coated plates and FB/ICM media formulations.
- Requires adaptation for human fibroblast sources and validation of transgene silencing in long-term culture.
- Limited by the need for antibiotic selection and potential silencing of retroviral constructs over time.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Generation of Neonatal Mouse Cardiac Fibroblasts via Explant Culture
3:20
Generation of Neonatal Mouse Cardiac Fibroblasts via Enzymatic Digestion
5:02
Isolation of Thy1.2+ Fibroblasts by Magnetic-activated Cell Sorting (MACS)
7:17
Retroviral Mediated Reprogramming of Isolated Cardiac Fibroblasts
8:52
Results: Retroviral Reprogramming of Cardiac Fibroblasts to Induced Cardiac Myocytes
9:38
Conclusion
