تطوير المناعي اختبار قطاع تستند الذهب الغروية عن الكشف عن الحيتان الميوجلوبين

الهدف العام من شريط اختبار الكروماتوغرافيا المناعي الذهبي الغروي هذا هو التمييز بين الميوغلوبين في الحيتانيات وتلك الموجودة في الفقمات الأخرى. يمكن أن توفر هذه الطريقة فحصا سريعا وفوريا للحوم الحيتانيات ، وبالتالي تقييد تجارتها واستهلاكها غير المشروعين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن ملاحظة النتيجة الناجحة مباشرة في غضون خمس إلى عشر دقائق بعد تجانس 03 جرام من العضلات ، مع خصوصية وحساسية رائعة.

لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة اكتشافا سريعا عن لحوم الحيتانيات في الحقل. يمكن أيضا تطبيقه على اللحوم الأخرى مثل لحم الخيل أو لحم الخنزير. لتصميم الببتيدات الاصطناعية لرفع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مع التفاعل تجاه الميوغلوبين في الحيتانيات ، يتم تحليل تسلسل الأحماض الأمينية للمناطق التفاعلية المستضدية للميوغلوبين من مختلفة.

ابدأ باسترداد تسلسل الأحماض الأمينية للميوغلوبين من التونة والدجاج والنعام والثدييات الداجنة والفقمة و 18 نوعا من الحيتانيات. بعد ذلك ، قم بمحاذاة التسلسلات باستخدام البرنامج المناسب. قم بتشغيل مستكشف المحاذاة عن طريق تحديد محاذاة التحرير/بناء المحاذاة على شريط التشغيل.

حدد Create New Alignment، ثم انقر فوق OK. سيظهر مربع حوار يسأل ، هل تقوم ببناء محاذاة تسلسل الحمض النووي أو البروتين؟ انقر فوق الزر المسمى بروتين ، وحدد Data Open Retrieve sequences from File ، وحدد ملف التسلسل. حدد أمر القائمة تحرير تحديد الكل لتحديد كافة المواقع لكل تسلسل في مجموعة البيانات لإنشاء محاذاة تسلسل متعددة.

حدد محاذاة المحاذاة بواسطة ClustalW من القائمة الرئيسية. حدد BLOSUM كمصفوفة وزن البروتين ثم انقر فوق OK زر. الخطوة الثالثة هي تحليل محاذاة التسلسل.

ركز على خمسة مواقع تفاعلية مستضدية وابحث عن الجزء المحفوظ بين الحيتانيات. ترمز العلامة النجمية إلى الإجماع في المحاذاة وتشير إلى الموضع الذي يحتوي على بقايا واحدة محفوظة بالكامل. تم العثور على شظيئتين محفوظتين في الحيتانيات.

ثم يتم تصنيع شظايا التسلسل المرشحة واستخدامها لرفع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. ابدأ هذا الإجراء بتحديد الرقم الهيدروجيني الأمثل لمحلول الذهب الغروي المعرف بأنه الحد الأدنى من الأس الهيدروجيني الذي يحافظ على الجسم المضاد أحادي النسيلة وخليط محلول الذهب الغروي أحمر اللون لمدة ساعتين. أضف 0.15 ميكروغرام من الجسم المضاد أحادي النسيلة المنقى إلى 100 ميكرولتر من محلول الذهب الغروي بقيم الأس الهيدروجيني التي تتراوح من خمسة إلى تسعة.

لأغراض هذا العرض التوضيحي ، يتم اختبار الأس الهيدروجيني ستة ودرجة الحموضة الثامنة. تم اعتبار الرقم الهيدروجيني ثمانية هو الرقم الهيدروجيني الأمثل من خلال خطوة التحسين هذه. بعد ذلك ، حدد التركيز الأمثل للجسم المضاد أحادي النسيلة عن طريق إضافة كميات مختلفة من الجسم المضاد أحادي النسيلة المنقى إلى 100 ميكرولتر من محلول الذهب الغروي عند درجة الحموضة ثمانية.

التركيز الأمثل ، وهو ستة ميكروغرام لكل مليلتر في هذه الدراسة ، سيحافظ على لون الخليط باللون الأحمر بدون راسب أسود. بناء على نتائج خطوات التحسين ، أضف 60 ميكروغراما من الأجسام المضادة أحادية النسيلة المنقى إلى 10 مل من محلول الذهب الغروي. استحلب الخليط برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق.

أضف ملليلترين من محلول BSA بنسبة 5٪ في PBS إلى الخليط واستحلبه برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لتقليل تداخل الخلفية. الطرد المركزي الخليط عند 10 ، 000 مرة جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية بجسم مضاد غير مترافق وقم بتعليق الحبيبات الناتجة في 4 مل من PBS-T التي تحتوي على 1٪ BSA و 0.1٪ Tween-20.

كرر الطرد المركزي والتعليق مرة أو مرتين. قم بتعليق الرواسب النهائية في 1 مل من PBS-T وتخزينها على أربع درجات مئوية حتى الاستخدام. يظهر هنا رسم بياني لتصميم الشريط المناعي.

سرد أبعاد الورق المقوى والوسادات وغشاء النيتروسليلوز في نص البروتوكول. لإطالة عمر التخزين ، يجب تحضير شرائط المناعة وتجميعها في حالة بيئية معملية منخفضة الرطوبة. استخدم ماصة دقيقة لإضافة محلول الأجسام المضادة أحادية النسيلة الغرواني الملصق بالذهب إلى الوسادة المترافقة لتشبعها ثم تجفيف الوسادة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل التجميع.

بمجرد أن تجف الوسادة المترافقة ، استخدم شريطا على الوجهين للصق غشاء النيتروسليلوز أولا على الورق المقوى. باستخدام طابعة شريط مناعي ، قم بتوزيع المستضد المحدد الذي يلتقط الجسم المضاد أحادي النسيلة و IGG السريع المضاد للفأر على منطقة الاختبار ومنطقة التحكم ، على التوالي ، على غشاء النيتروسليلوز. حافظ على مسافة أكبر من خمسة ملليمترات بين المنطقتين.

ثم قم بلصق الوسادة المترافقة على جانب واحد من غشاء النيتروسليلوز ، والوسادة الماصة على الجانب الآخر ، متداخلة مع الوسادات على كل جانب بحوالي ملليمترين. ضع وسادة العينة فوق الوسادة المترافقة بمقدار ملليمترين وقم بلصقها على الورق المقوى. استخدم قاطع الورق لإنشاء شرائط بعرض ستة ملليمترات.

قم بتعبئة الشرائط في كيس من رقائق الألومنيوم مع المجفف وتخزينها على حرارة أربع درجات مئوية حتى الاستخدام. لتحضير عينة لاختبار التفاعل المتبادل ، أضف 1 مل من PBS يحتوي على 0.1٪ BSA إلى 0.03 جرام من العضلات الخام. واستخدم عصا من الخيزران أو قضيب طحن لتجانس العينة.

أمسك الشريط المناعي بالطرف المقابل لمنطقة الاختبار واغمس جزء وسادة العينة في العينة لمدة خمس إلى عشر دقائق. راقب النتيجة مباشرة. اختبر عينات العضلات المختلفة بثلاث نسخ.

تم تصميم خط اختبار T لإظهار إشارة إيجابية عندما يكتشف كلا الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ميوغلوبين الحيتانيات. نظرا لأنه لا يمكن اكتشاف الميوغلوبين من غير الحيمية إلا بواسطة أحد هذين الجسمين المضادين أحادي النسيلة ، فإن خط الاختبار يظهر نتيجة سلبية عند اختبار عينات العضلات من الأخرى. يجب أن يظهر خط التحكم C دائما نتيجة إيجابية لأن IGG السريع المضاد للفأر يربط الجسم المضاد للكشف الغرواني المسمى بالذهب.

تشير النتيجة الفاشلة في خط التحكم إلى أن جودة المواد الموجودة على الشريط رديئة. يظهر تحليل الدم الغربي باستخدام المواد الطافية للورم الهجين أن الجسم المضاد أحادي النسيلة CGF5H9 يكتشف الحيتانيات والثدييات الأخرى كشريط ملطخ واحد بوزن جزيئي متوقع يبلغ حوالي 17 كيلو دالتون. يظهر حوت المنك الشائع نطاقا باهتا نسبيا من عصابات الحيتانيات الأخرى.

العصابات غائبة للتونة والفقمة والدجاج. في حين لوحظ وجود نطاق عند حوالي 50 كيلو دالتون للخنزير. يتم الحصول على نتائج متطابقة عن طريق تحليل الدم النقطي.

على الرغم من أن تحليل الدم الغربي باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة CSF1H13 يظهر العديد من النطاقات غير المحددة للخنازير والتونة ، إلا أن CSF1H13 محدد للغاية لأنه يتفاعل فقط مع الحيتانيات. والختم له نطاق بوزن جزيئي متوقع يبلغ حوالي 17 كيلو دالتون. يتم الحصول على نتائج متطابقة عن طريق تحليل الدم النقطي.

تظهر نتائج ELISA غير المباشرة لمستخلصات العضلات من أنواع مختلفة باستخدام CGF5H9 المنقى إشارات إيجابية للبقرة والماعز والأرانب والحيتانيات ، وإشارة إيجابية ضعيفة للخنازير ، وإشارات سلبية للتونة والدجاج والفقمة. يظهر CSF1H13 تقاربا كبيرا تجاه الحيتانيات والفقمات. يمكن أن يتفاعل كلا الأجسام المضادة وحيدة النسيلة بقوة مع جميع أنواع الحيتانيات الأربعة التي تنتمي إلى عائلات مختلفة ، مما يشير إلى تفاعلهما الواسع مع أنواع الحيتانيات المتنوعة.

خصوصية الشريط الذهبي الغروي المناعي من خلال هذه النتائج التمثيلية. ينتج عن استخدام عينات العضلات غير الحيمية شريط واحد فقط في خط التحكم. ومع ذلك ، عند استخدام عينات من عضلات الحيتانيات ، تكون نطاقات الإشارة موجودة في كل من خط الاختبار وخط التحكم.

بمجرد إتقانها ، يمكن تحضير الأجسام المضادة المصنفة وبناء الشرائط هذا في أربع ساعات إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تصميم الببتيد بعناية. استخدم عدة طرق لفحص الأجسام المضادة أحادية النسيلة المناسبة.

واستخدم جودة عالية من الذهب الغروي لتحضير الأجسام المضادة المصنفة. باتباع هذه الإجراءات ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل الحمض النووي القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل أنواع الحيتانيات ومن أين أتت. يمكن استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة CSF1H13 وهو قوي ويظهر تقاربا تجاه الثدييات البحرية فقط في أشكال مختلفة من ELISA التي توفر العديد من الفرص الأخرى لدراسة الجوانب البيولوجية والفسيولوجية والكيميائية للميوغلوبين في الثدييات البحرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير أجسام مضادة وحيدة النسيلة محددة ثم تطبيقها لاحقا على شريط اختبار سريع.