تطوير المناعي اختبار قطاع تستند الذهب الغروية عن الكشف عن الحيتان الميوجلوبين

الهدف العام من شريط اختبار الكروماتوغرافيا المناعية بالذهب الغروي هو التمييز بين الميوجلوبين الخاص بالحيتانيات والميوجلوبين الخاص بالفقمات والحيوانات الأخرى. يمكن لهذه الطريقة توفير فحص سريع وميداني للحوم الحيتانيات، مما يساهم في الحد من التجارة والاستهلاك غير القانونيين لها. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية ملاحظة النتيجة الناجحة مباشرةً خلال خمس إلى عشر دقائق بعد تجنيس 0.3 gram من العضلات، مع خصوصية وحساسية فائقتين.

وبذلك، يمكن لهذه الطريقة توفير كشف سريع عن لحوم الحيتانيات في الميدان. كما يمكن تطبيقها على أنواع أخرى من اللحوم مثل لحم الخيل أو لحم الخنزير. ولتصميم ببتيدات اصطناعية لإنتاج أجسام مضادة أحادية النسيلة ذات تفاعلية تجاه الميوجلوبين الخاص بالحيتانيات، يتم تحليل تسلسلات الأحماض الأمينية للمناطق المستضدية التفاعلية للميوجلوبين من حيوانات مختلفة.

ابدأ باستخراج تتابعات الأحماض الأمينية للميوغلوبين من GenBank لكل من التونة، والدجاج، والنعام، والثدييات المستأنسة، والفقمة، و18 نوعاً من الحيتانيات. بعد ذلك، قم بمحاذاة التتابعات باستخدام البرامج المناسبة. قم بتشغيل مستكشف المحاذاة (Alignment Explorer) عبر اختيار Align Edit/Build Alignment من شريط التشغيل.

اختر Create New Alignment، ثم انقر فوق OK. سيظهر مربع حوار يسألك عما إذا كنت تقوم بإنشاء محاذاة لتسلسلات DNA أو بروتين. انقر فوق الزر المسمى Protein، واختر Data Open Retrieve sequences from File، ثم حدد ملف التسلسلات. اختر أمر القائمة Edit Select All لتحديد جميع المواقع لكل تسلسل في مجموعة البيانات لإنشاء محاذاة تسلسلات متعددة.

اختر Align Alignment Align by ClustalW من القائمة الرئيسية. حدد BLOSUM كصفوف أوزان البروتين ثم انقر فوق زر OK. الخطوة الثالثة هي تحليل محاذاة التسلسل.

ركز على خمسة مواقع تفاعلية مستضدية وابحث عن الجزء المحفوظ بين الحيتانيات. ترمز النجمة إلى التوافق في المحاذاة وتشير إلى موضع يحتوي على بقية واحدة محفوظة بالكامل. تم العثور على جزأين محفوظين في الحيتانيات.

تُصنّع بعد ذلك شظايا التسلسلات المرشحة وتُستخدم لتحفيز إنتاج أجسام مضادة أحادية النسيلة. ابدأ هذا الإجراء بتحديد الرقم الهيدروجيني (pH) الأمثل لمحلول الذهب الغروي، والذي يُعرَّف بأنه أدنى قيمة pH تحافظ على اللون الأحمر لمزيج الجسم المضاد أحادي النسيلة ومحلول الذهب الغروي لمدة ساعتين. أضف 0.15 µg من الجسم المضاد أحادي النسيلة الكاشف المنقى إلى 100 µL من محلول الذهب الغروي بقيم pH تتراوح من خمسة إلى تسعة.

لأغراض هذا العرض التوضيحي، تم اختبار pH 6 و pH 8. وقد اعتبر pH 8 هو الرقم الهيدروجيني الأمثل بناءً على خطوة التحسين هذه. بعد ذلك، يتم تحديد التركيز الأمثل للأجسام المضادة أحادية النسيلة عن طريق إضافة كميات متنوعة من الأجسام المضادة أحادية النسيلة الكاشفة المنقاة إلى 100 µL من محلول الذهب الغروي عند pH 8.

سوف يحافظ التركيز الأمثل، وهو 6 µg/mL في هذه الدراسة، على لون المزيج الأحمر دون وجود راسب أسود. بناءً على نتائج خطوات التحسين، أضف 60 µg من الجسم المضاد أحادي النسيلة الكاشف المنقى قطرة تلو الأخرى إلى 10 mL من محلول الذهب الغروي. استحلِب المزيج برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق.

أضف 2 mL من محلول BSA بتركيز 5% في PBS إلى الخليط، وقم بعملية الاستحلاب بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لتقليل التداخل في الخلفية. قم بطرد الخليط مركزياً عند 10,000 ×g لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة السائل الطافي الذي يحتوي على الأجسام المضادة غير المقترنة بعناية، ثم قم بتعليق الراسب الناتج في 4 mL من PBS-T الذي يحتوي على 1% BSA و0.1% Tween-20.

كرر عمليتي الطرد المركزي والتعليق مرة أو مرتين. قم بتعليق الرواسب النهائية في 1mL من PBS-T واحفظها في درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى وقت الاستخدام. يظهر هنا رسم توضيحي لتصميم الشريط المناعي.

توجد أبعاد الورق المقوى، والوسادات، وغشاء النيتروسليلوز مدرجة في نص البروتوكول. ولإطالة مدة التخزين، يجب تحضير الشرائط المناعية وتجميعها في ظروف بيئية معملية منخفضة الرطوبة. استخدم ماصة دقيقة لإضافة محلول الجسم المضاد أحادي النسيلة الملحق بالذهب الغروي إلى وسادة الاقتران لتشبيعها، ثم جفف الوسادة عند 37 °C لمدة ساعة واحدة قبل التجميع.

بمجرد جفاف وسادة الاقتران، استخدم شريطاً لاصقاً من الجهتين للصق غشاء النيتروسيلولوز أولاً على قطعة الكرتون. وباستخدام طابعة الشرائط المناعية، قم بتوزيع الجسم المضاد أحادي النسيلة النوعي لالتقاط المستضد وبروتين anti-mouse IGG السريع على منطقة الاختبار ومنطقة التحكم، على التوالي، فوق غشاء النيتروسيلولوز. حافظ على مسافة تزيد عن خمسة مليمترات بين المنطقتين.

ثم قم بلصق وسادة الاقتران على أحد جانبي غشاء النيتروسليلوز، ووسادة الامتصاص على الجانب الآخر، مع جعل الوسادات تتداخل بمقدار مليمترين تقريباً على كل جانب. ضع وسادة العينة فوق وسادة الاقتران بمقدار مليمترين وقم بلصقها على الورق المقوى. استخدم قاطع الورق لإنشاء شرائط بعرض ستة مليمترات.

ضع الشرائط في كيس من رقائق الألومنيوم مع مادة مجففة واحفظها عند درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى وقت الاستخدام. ولتحضير عينة لاختبار التفاعل المتبادل، أضف 1mL من PBS المحتوي على 0.1%BSA إلى 0.03 grams من العضلات الخام. ثم استخدم عود خيزران أو قضيب طحن لمجانسة العينة.

أمسك الشريط المناعي من الطرف المقابل لمنطقة الاختبار، واغمر جزء وسادة العينة في العينة لمدة تتراوح من خمس إلى عشر دقائق. لاحظ النتيجة مباشرة. اختبر عينات عضلية متنوعة في ثلاث مكررات.

صُمم خط الاختبار T لإظهار إشارة إيجابية عندما يكتشف كلا الجسمين المضادين أحاديَي النسيلة الميوجلوبين الخاص بالحيتانيات. ونظرًا لأن الميوجلوبين المستخلص من الحيوانات غير الحيتانية يمكن اكتشافه بواسطة واحد فقط من هذين الجسمين المضادين أحاديَي النسيلة، فإن خط الاختبار يظهر نتيجة سلبية عند اختبار عينات عضلية من حيوانات أخرى. أما خط التحكم C فيجب أن يظهر دائمًا نتيجة إيجابية لأن مضاد الفأر IGG السريع يرتبط بالجسم المضاد الكاشف المسمى بذهب الغروي.

تشير النتيجة السلبية في خط التحكم (Control line) إلى رداءة جودة المواد الموجودة على الشريط. ويُظهر تحليل لطخة ويسترن للدم باستخدام نواتج فائض الهجين (hybridoma supernatants) أن الجسم المضاد أحادي النسيلة CGF5H9 يكشف عن الحيتانيات والثدييات الأخرى كحزمة ملونة واحدة عند وزن جزيئي متوقع يبلغ حوالي 17kDa. ويُظهر حوت مينك الشائع حزمة باهتة نسبياً مقارنة بحزم الحيتانيات الأخرى.

تغيب الحزم في حالة التونة والفقمة والدجاج. بينما لوحظ وجود حزمة عند حوالي 50kDa في حالة الخنزير. وتم الحصول على نتائج متطابقة عن طريق تحليل نقاط الدم.

على الرغم من أن تحليل الدم الغربي باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة CSF1H13 يُظهر حزمًا متعددة غير نوعية للخنزير والتونة، إلا أن CSF1H13 يتميز بنوعية عالية لأنه يتفاعل فقط مع الحيتانيات. ويُظهر الفقمة حزمة عند وزن جزيئي متوقع يبلغ حوالي 17kDa. وقد تم الحصول على نتائج متطابقة من خلال تحليل نقطة الدم.

تُظهر نتائج تحليل ELISA غير المباشر لمستخلصات عضلات أنواع مختلفة باستخدام CGF5H9 المنقى إشارات إيجابية للأبقار والماعز والكلاب والأرانب والحيتانيات، وإشارة إيجابية ضعيفة للخنازير، وإشارات سلبية للتونة والدجاج والفقمة. أما CSF1H13 فيُظهر ألفة عالية تجاه الحيتانيات والفقمات. ويمكن لكلا الجسمين المضادين أحاديي النسيلة التفاعل بقوة مع جميع أنواع الحيتانيات الأربعة التي تنتمي إلى عائلات مختلفة، مما يشير إلى تفاعليتهما الواسعة تجاه أنواع متنوعة من الحيتانيات.

تظهر هذه النتائج التمثيلية خصوصية شريط الذهب الغروي المناعي. يؤدي استخدام عينات عضلات من غير الحوتيات إلى ظهور حزمة واحدة فقط عند خط التحكم. ومع ذلك، عند استخدام عينات عضلات الحوتيات، تظهر حزم الإشارة عند كل من خط الاختبار وخط التحكم.

بمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إتمام تحضير الأجسام المضادة الموُسمة وبناء الشرائط في غضون أربع ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح. وعند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر تصميم الببتيد بعناية. استخدم عدة طرق لفحص الأجسام المضادة أحادية النسيلة المناسبة.

واستخدم ذهباً غروياً عالي الجودة لتحضير أجسام مضادة مُوسومة. وباتباع هذه الإجراءات، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تحليل DNA القائم على تقنية PCR للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد نوع الحوتيات ومصدرها. يمكن استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة CSF1H13، الذي يتميز بقوة وارتباط انتقائي بالثدييات البحرية فقط، في صيغ متنوعة من تقنية ELISA، مما يفتح فرصاً عديدة أخرى لدراسة الجوانب البيولوجية والفسيولوجية والكيميائية للميوغلوبين في الثدييات البحرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تطوير أجسام مضادة أحادية النسيلة محددة، ومن ثم تطبيقها على شريط اختبار سريع.