تحليل تصفية عينات الهواء لالسموم الداخلية والمحتوى الحمض النووي

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف كيفية تحليل محتوى الإندوتوكسين والحمض النووي DNA بدقة في الجسيمات المحمولة جواً والمستخلصة من المرشحات. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في أبحاث الهباء الجوي البيولوجي الداخلي والخارجي، مثل فهم الأسباب الصحية. وسيقوم Yinon Mazar، وهو طالب دراسات عليا من مختبري، بتوضيح إجراء أخذ العينات باستخدام المرشح.

بالنسبة لأخذ العينات بكميات كبيرة، استخدم مرشحات مصنوعة من ألياف الكوارتز. أو اختر النوع المحدد من المرشح بالإضافة إلى حجم قطع المرشح الذي يناسب احتياجات البحث بشكل أفضل. قم بالتحميض المسبق للمرشحات المخصصة لأخذ عينات المركبات العضوية والبيولوجية عن طريق لفها أولاً بشكل فردي في رقائق الألومنيوم.

ثم يتم خبزها في فرن مختبري عند 450 درجة مئوية لمدة خمس ساعات على الأقل. سيؤدي ذلك إلى تدمير أي بقايا عضوية موجودة مسبقاً. تُحفظ المرشحات المخبوزة عند 20 درجة مئوية حتى يحين موعد استخدامها في أخذ العينات.

بعد ذلك، قم بتنظيف وتطهير جهاز أخذ العينات عالي الحجم، مثل الجهاز الموصوف في البروتوكول النصي المرفق. ثم ضع المرشح المخبوز مسبقاً في كاسيت المرشح وقم بتشغيل جهاز أخذ العينات وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لجمع عينة مناسبة. وفي كابينة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية، قص 22 قطعة دائرية من مادة المرشح النظيفة والمخبوزة مسبقاً باستخدام ثاقب فلين نظيف بقطر 1.12 centimeter.

استخدم هذه القطع لتحضير مجموعة من المرشحات المطعمة بالسموم الداخلية لاستخدامها كضوابط. بعد ذلك، قم بقص المرشحات التي تحتوي على العينة المجمعة باستخدام ثاقب فلين نظيف بقطر 1.12 centimeter، وضع كل عينة في أنبوب سعة 2 millileter خالٍ من مسببات الحمى. كذلك، قم بنقل المرشحات المجففة المطعمة بالسموم الداخلية إلى أنابيب منفصلة سعة 2 millileter خالية من مسببات الحمى.

أضف 1 mL من الماء الخالي من مسببات الحمى إلى كل أنبوبة. ثم رجّها لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام رجّاج مختبري. بعد ذلك، قم بطرد عينات الأنابيب مركزياً في جهاز طرد مركزي دقيق بسرعة 375 ×g لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، انقل الطافي الذي يحتوي على السموم الداخلية إلى أنبوب جديد سعة 2 mL خالٍ من مسببات الحمى. جهز صفيحة دقيقة ذات قاع مسطح بـ 96 بئرًا وغطاء تكون خالية من مسببات الحمى لإجراء اختبار السموم الداخلية، وذلك بتحديد مواقع العينات أولاً.

بعد ذلك، قم بتشغيل قارئ الأطباق الدقيقة (microplate reader) وبرمجته لإجراء تفاعل حركي عند 37 °C مع الرج كل خمس دقائق، تليها قياسات عند 405 نانومتر. كرر عملية الرج لمدة خمس دقائق وقراءة الطبق 18 مرة.

قم بتحميل العينات في لوحة الاختبار عن طريق وضع 50 µL من محلول الداخلي السموم القياسية (standard endotoxin solutions) المستخدم سابقاً في تدعيم المرشحات في الصفوف من A1 إلى A10 ومن B1 إلى B10. ضع العينات الفارغة (blanks) في A11 وA12 وB11 وB12. بعد ذلك، أضف الطافي (supernatant) من مستخلص المرشح المدعم الذي تم طرده مركزياً وعيناته الفارغة في الصفين C وD. ثم أضف الطافي من العينات التجريبية والعينات الفارغة في الآبار المتبقية حسب الحاجة.

لتنشيط الاختبار، أضف بسرعة 50 µL من محلول limulus amebocyte glycate إلى كل بئر. رجّ اللوحة برفق بشكل أفقي، وذلك قبل رفعها ووضعها في قارئ الأطباق وبدء التشغيل التجريبي.

بمجرد الانتهاء، قم بإخراج الصفيحة من قارئ الصفائح. حدد مستوى الداخلي سموم (endotoxin) في كل عينة باستخدام المنحنى القياسي، واحسب أيضاً كفاءة استخلاص الداخلي سموم من مرشحات العينات. أولاً، قم بتحضير المرشحات المضاف إليها DNA كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق.

لكل عينة مرشح، قم بتحضير خليط من الخرز الزجاجي المغسول بالحمض في أنابيب معقمة سعة 0.5 milliliter، بحيث تحتوي على 0.1 grams من الخرز الذي يتراوح قطره بين 425 إلى 600 micrometers و0.3 grams من الخرز الذي يبلغ قطره 106 micrometers أو أقل. بعد ذلك، استقطع ثلاث قطع دائرية من مواقع مختارة عشوائياً من كل عينة مرشح باستخدام ثاقب فلين معقم بقطر 1.12 centimeter. ضع عينات المرشح في أنابيب فردية ذات غطاء لولبي سعة two milliliter.

بعد ذلك، أضف خليط الخرز الزجاجي إلى كل أنبوب مع 60 µL من منظم استخلاص الخلايا (cell lysis buffer) المرفق مع طقم استخلاص DNA. أغلق الأنابيب وضع العينات في جهاز تحطيم الخلايا بالخرز (bead beater). استخدم جهاز تحطيم الخلايا بالخرز لتفتيت الخلايا المُرشحة ميكانيكياً لمدة دقيقة واحدة، ثم بَرِّد العينات بوضعها على الثلج لمدة دقيقة إضافية.

كرر هذه الدورة خمس مرات. استمر في اتباع بروتوكول مورد الطقم واستخلص DNA من الخلايا المحللة. بعد عملية الاستخلاص، أعد تحميل العينة المستخلصة عبر عمود الاستخلاص مرة ثانية لتحسين حصيلة DNA.

قم بتشغيل جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) مسبقاً لإعطائه الوقت الكافي للإحماء. في ملف برنامج جديد، أدخل تفاصيل عملية التشغيل الخاصة بـ qPCR في برنامج تشغيل الجهاز. بعد ذلك، قم بتطهير سطح العمل باستخدام مزيل تلوث DNA للأسطح، واعمل فقط باستخدام أنابيب ورؤوس ماصات وكواشف معقمة.

كذلك، ضع دلواً من الثلج بجانب طاولة العمل وضع مزيج tac polemoraris في الدلو. قم بتحضير مزيج تفاعل quantitative PCR كما هو موضح في الجدول 4 من البروتوكول النصي المصاحب. واحفظ مزيج التفاعل في الظلام وعلى الثلج حتى حين استخدامه.

بعد ذلك، ضع لوحة معايرة دقيقة (microplate) نظيفة في حامل الأطباق لمنعها من ملامسة سطح العمل وللحفاظ على نظافتها. أضف 1 µL من الحمض النووي القياسي (standard DNA)، أو الحمض النووي للعينة، أو الماء الخالي من النوكلياز داخل آبار لوحة PCR الكمي في ثلاث نسخ مكررة. ثم أضف 9 µL من خليط التفاعل الرئيسي في كل بئر تفاعل.

عند الانتهاء، غطِّ الطبق بفيلم لاصق بصري وأغلقه بإحكام من جميع الجوانب. قم بتدوير الطبق في جهاز طرد مركزي مجهز بحوامل أطباق لمدة دقيقة واحدة عند 1000 ×g، وذلك قبل وضعه في جهاز التدوير الحراري. وأخيرًا، قم بتنشيط وتشغيل برنامج PCR الكمي المُعد مسبقًا.

أثناء عملية استخلاص الإندوتوكسين، تُوضع عينات المرشح في جهاز طرد مركزي لاستخلاص الإندوتوكسين من المرشح. وتؤدي سرعات الطرد المركزي المختلفة إلى كفاءات استخلاص متفاوتة، خاصة عند التركيزات العالية من الإندوتوكسين.

يجب إجراء اختبار أولي لكفاءة الاستخلاص للمرشح المحدد المختار والبروتوكول المتبع. يتم الحصول على كفاءات استخلاص أعلى من خلال إضافة مادة قياسية إلى مرشحات نظيفة مقارنة بالمرشحات الكوارتزية التي تم أخذ عينات منها، وكلا هاتين الكفاءتين أقل من تلك التي يتم تحقيقها عبر الكشف المباشر للمحلول القياسي. وبمجرد إتقان العملية، يمكن إتمام تحليل الإندوتوكسين في غضون ثلاث ساعات ونصف إذا تم تنفيذه بشكل صحيح.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل DNA من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بنقل الكائنات الحية في الغلاف الجوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخلاص السموم الداخلية و DNA بكفاءة من مرشحات عينات الهواء وتحليلها بدقة.