تحليل تصفية عينات الهواء لالسموم الداخلية والمحتوى الحمض النووي

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف كيفية التحليل الدقيق للسموم الداخلية ومحتوى الحمض النووي للجسيمات المحمولة جوا المستخرجة التي تم أخذ عينات منها على المرشحات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أبحاث الهباء الجوي البيولوجي الداخلي والخارجي ، مثل فهم الأسباب الصحية. يوضح إجراء أخذ العينات بالمرشح Yinon Mazar ، طالب دراسات عليا من مختبري.

لأخذ العينات بكميات كبيرة ، استخدم المرشحات المصنوعة من ألياف الكوارتز. أو اختر النوع المحدد من المرشح بالإضافة إلى حجم قطع المرشح الذي يناسب احتياجات البحث على أفضل وجه. اخبز المرشحات المخصصة لأخذ عينات المركبات العضوية والبيولوجية مسبقا عن طريق لفها أولا بشكل فردي بورق الألمنيوم.

ثم خبزها في فرن مختبر على حرارة 450 درجة مئوية لمدة خمس ساعات على الأقل. سيؤدي ذلك إلى تدمير أي بقايا عضوية موجودة مسبقا. قم بتخزين المرشحات المخبوزة على حرارة 20 درجة مئوية حتى يتم استخدامها لأخذ العينات.

بعد ذلك ، قم بتنظيف وتعقيم جهاز أخذ العينات بكميات كبيرة مثل الموصوف في بروتوكول النص المصاحب. بعد ذلك ، ضع الفلتر المخبوز مسبقا في كاسيت الفلتر وقم بتشغيل جهاز أخذ العينات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لجمع عينة مناسبة. في خزانة السلامة الحيوية من الدرجة الثانية ، قم بقص 22 قطعة دائرية من مادة الترشيح النظيفة المخبوزة مسبقا باستخدام حفار فلين نظيف بقطر 1.12 سم.

استخدم هذه القطع لإعداد مجموعة من المرشحات المسننة بالسموم الداخلية لاستخدامها كعناصر تحكم. بعد ذلك ، قم بقص المرشحات التي تحتوي على العينة التي تم جمعها باستخدام حفار فلين نظيف بقطر 1.12 سم وضع كل عينة في أنبوب مليليتر خال من البيروجين. أيضا ، انقل المرشحات المسننة للسموم الداخلية المجففة إلى أنبوبين منفصلين خاليين من البيروجين.

أضف ملليلتر واحد من الماء الخالي من البيروجين إلى كل أنبوب. ورجها لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام شاكر المختبر. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لأنابيب العينة في جهاز طرد مركزي دقيق عند 375 مرة G لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم بنقل المادة الطافية التي تحتوي على السموم الداخلية إلى أنبوب جديد خال من البيروجين سعة ملليلتر. قم بإعداد صفيحة دقيقة خالية من البيروجين 96 بئر ذات قاع مسطح مع غطاء لاختبار السموم الداخلية. من خلال وضع مواقع العينة أولا.

بعد ذلك ، قم بتشغيل قارئ الصفيحة الدقيقة وبرمجته لتفاعل حركي عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز كل خمس دقائق. تليها قياسات عند 405 نانومتر. كرر المخفوق لمدة خمس دقائق وقراءة الطبق 18 مرة.

قم بتحميل العينات في الأسكات عن طريق وضع 50 ميكرولترا من محاليل السموم الداخلية القياسية المستخدمة سابقا لرفع المرشحات في الصفوف من A1 إلى A10 ومن B1 إلى B10. ضع الفراغات في A11 و A12 و B11 و B12. بعد ذلك ، أضف المادة الطافية من مستخلص المرشح المسننة المغزولة وفراغاتها إلى الصفوف C و D. ثم أضف المواد الطفية من العينات التجريبية والفراغات إلى الآبار المتبقية حسب الحاجة.

لتنشيط الاختبار ، أضف بسرعة 50 ميكرولترا من محلول الجليكات الأميبوسيت إلى كل بئر. رج الطبق برفق أفقيا. قبل رفعه إلى قارئ اللوحة وبدء التشغيل التجريبي.

بمجرد الانتهاء ، قم بإزالة اللوحة من قارئ اللوحة. حدد مستوى السموم الداخلية في كل عينة باستخدام المنحنى القياسي ، وكذلك احسب الكفاءة التي يتم بها استخراج السموم الداخلية من مرشحات العينة. أولا ، قم بإعداد مرشحات الحمض النووي المسننة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب.

لكل عينة مرشح ، قم بإعداد خليط من الخرز الزجاجي المغسول بالحمض إلى أنابيب معقمة سعة 0.5 ملليلتر عند 0.1 جرام من الخرزات التي يبلغ قطرها 425 إلى 600 ميكرومتر و 0.3 جرام من الخرزات التي يقل قطرها عن أو يساوي 106 ميكرومتر. بعد ذلك ، قم بقص ثلاث قطع دائرية من مواقع مختارة عشوائيا على كل عينة مرشح باستخدام حفار فلين مطهر بقطر 1.12 سم. ضع عينات المرشح في أنبوب مليلتر فردي أعلى لولب.

بعد ذلك ، أضف خليط الخرز الزجاجي إلى كل أنبوب مع 60 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحلل الخلية المزود بمجموعة استخراج الحمض النووي. أغلق الأنابيب وضع العينات في مضرب الخرزة. استخدم مضرب الخرزة لتعطيل الخلايا المفلترة ميكانيكيا لمدة دقيقة واحدة ثم قم بتبريد العينات عن طريق وضعها على الجليد لمدة دقيقة إضافية.

كرر هذه الدورة خمس مرات. تابع اتباع بروتوكول مورد المجموعة واستخراج الحمض النووي من الخلايا المحللة. بعد الشطف ، أعد تحميل العينة المملوءة من خلال عمود الاستخراج مرة ثانية لتحسين إنتاجية الحمض النووي.

قم بتشغيل أداة PCR الكمية مسبقا للسماح لها بوقت للإحماء. في ملف برنامج جديد ، أدخل تفاصيل تشغيل PCR الكمي في برنامج تشغيل الأجهزة. بعد ذلك ، قم بتطهير سطح العمل بمزيل الحمض النووي السطحي واعمل فقط باستخدام الأنابيب والنصائح والكواشف المعقمة.

أيضا ، ضع دلوا من الثلج بجوار مقعد العمل وضع مزيج tac polemoraris في الدلو. قم بإعداد مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي كما هو موضح في الجدول الرابع من بروتوكول النص المصاحب. وقم بتخزين مزيج التفاعل في الظلام وعلى الثلج حتى الاستخدام.

بعد ذلك ، ضع صفيحة دقيقة نظيفة في حامل اللوحة لمنعها من لمس سطح العمل والحفاظ عليها نظيفة. أضف ميكرولتر واحدا من الحمض النووي القياسي أو عينة من الحمض النووي أو الماء الخالي من النوكلياز ، داخل آبار الصفيحة الدقيقة الكمية PCR في ثلاث نسخ. ثم أضف تسعة ميكرولترات من مزيج التفاعل الرئيسي في كل تفاعل جيدا.

عند الانتهاء ، قم بتغطية اللوحة بغشاء لاصق بصري وأغلقها بإحكام من جميع الجوانب. قم بتدوير اللوحة في جهاز طرد مركزي مزود بدلاء لوحة لمدة دقيقة واحدة عند 1000 مرة G.قبل وضعها في الدراجة الحرارية. أخيرا ، قم بتفعيل وتشغيل برنامج PCR الكمي المعد.

أثناء استخراج السموم الداخلية ، يتم تدوير عينات المرشح على جهاز طرد مركزي لاستخراج السم الداخلي من الفلتر. تؤدي سرعات الطرد المركزي المختلفة إلى كفاءات استخراج مختلفة. خاصة عند تركيزات السموم الداخلية الأعلى.

يجب إجراء اختبار أولي لكفاءة الاستخراج للمرشح المحدد المختار والبروتوكول الذي تم إجراؤه. يتم الحصول على كفاءات استخراج أعلى من ارتفاع المرشحات النظيفة مقارنة بمرشحات الكوارتز المأخوذة من عينات ، وكل من هذه الكفاءات أقل من تلك التي تم تحقيقها من خلال الكشف المباشر عن الحل القياسي. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تحليل السموم الداخلية في غضون ثلاث ساعات ونصف إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل الحمض النووي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بنقل الكائنات الحية في الغلاف الجوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج السموم الداخلية والحمض النووي بكفاءة من مرشحات عينات الهواء وتحليلها بدقة.