ضبط عمود مقطع التدفق الموازي وتمكين الكشف المضاعفة

الهدف العام من إجراء الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) هذا هو ضبط عمود تدفق مجزأ متوازي لتمكين الكشف المتعدد. تجيب هذه الطريقة على أسئلة رئيسية في مجالات الصحة والعافية، والعلوم البيئية، والطب الشرعي، وأي مجالات تتطلب تحليل عينات معقدة مثل الاكتشافات الحيوية. تتيح هذه التقنية إجراء تحليل شامل للعينة مع تقديم معلومات حول الطبيعة الكيميائية والنشاط الحيوي للمواد في المخاليط المعقدة.

تسمح بروتوكولات الكشف المتعدد أيضًا بإجراء تحليل سريع. تُمكّن هذه الطريقة من تطوير استراتيجيات لتحديد البصمة الكيميائية للمزيجات المعقدة، مثل القهوة والنبيذ، مما يتيح للمصنعين التمييز بين منتجاتهم والأصناف المقلدة الرخيصة. في البداية، قد يبدو من غير المألوف عدم إرسال العينة بأكملها إلى كاشف واحد فقط لإجراء تحليل دقيق.

ومع ذلك، فإن تركيز المادة المُحللة داخل كل تيار تدفق أعلى من إجمالي تيار التدفق في العمود التقليدي. للبدء، قم بتجهيز جهاز HPLC باستخدام ماء 100%UE وميثانول نقي كمراحل متحركة A وB على التوالي. في حال استخدام كاشف MS، أضف 0.1% حمض الفورميك إلى كلتا المرحلتين المتحركتين، ثم قم بتطهير مضخات HPLC وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

قم بتجميع كواشف MS UV VS و DPPH وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. تأكد من ترتيب المكونات بشكل مناسب، بحيث يكون الحجم الميت في خطوط الكواشف في حدوده الدنيا.

ثم اضبط الطول الموجي لكاشف UV VISTA على الطول الموجي الخاص بالعينة هنا. 280 نانومتر لكاشف MS. استخدم الوضع الموجب لتحليل إجمالي عدد الأيونات أو TIC مع طريقة الكشف بالمسح الكامل.

قم بموازنة درجة الحرارة وتدفق الغاز في كاشف MS وفقاً للقيم التالية: درجة حرارة المبخر 500 °C، ودرجة حرارة الشعيرة 350 °C، وتدفق الغاز المساعد 40 وحدة، وتدفق غاز المسح 5 وحدات، ومعدل غاز الغلاف 60 وحدة، وجهد الرش 3.5 kV. ولتحضير كاشف جذور DPPH، ابدأ بإذابة 25 mg من جذور DPPH في 250 mL من الميثانول في دورق حجمي.

أضف 250 µL من حمض الفورميك إلى المحلول وقم بمعالجته بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بتغطية الدورق وبورق الألمنيوم لمنع التعرض للضوء. بعد ذلك، قم بتطهير المضخة باستخدام محلول جذور DPPH وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة لإعداد نظام جذور DPPH.

تأكد من تثبيت خط المضخة في مدخل قطعة T، ثم قم بتوصيل ملف التفاعل بسعة 100 µL بمخرج قطعة T. قم بتوصيل الكاشف بالطرف الآخر من غطاء حالة ملف التفاعل ENC، وملف التفاعل، ومسخن العمود. أخيرًا، اضبط كاشف UV V لجذور DPPH على 520 nm.

لبناء عمود التدفق المجزأ المتوازي (PSF)، قم أولاً بتوصيل مدخل العمود بجهاز HPLC. بعد ذلك، استخدم قطعة من الأنابيب لتوصيل المنفذ المركزي بكاشف MS. استخدم أنابيب بنفس الأبعاد لتوصيل أحد منافذ العمود الطرفية بكاشف UV VS والآخر بالقطعة T الخاصة بنظام الكشف عن جذور DPPH.

قم بسد أي منافذ طرفية غير مستخدمة باستخدام سدادات الأعمدة. اضبط معدل تدفق جهاز HPLC على 1 mL في الدقيقة من الطور المتحرك B بنسبة 100% لعمود قطره الداخلي 4.6 mm وطوله 250 mm. اترك النظام للوصول إلى حالة التوازن لمدة 20 دقيقة.

لبدء ضبط نظام PSF، قم أولاً بالتصريف في أوعية تجميع فارغة. استخدم هذه القوارير لجمع الطور المتحرك بشكل منفصل من منافذ UV VS وDPPH radical. دوّن فترة زمنية التجميع واجمع 500 milligrams على الأقل من المذيب في كل وعاء.

بعد ذلك، قم بوزن أوعية الجمع لتحديد كتلة الطور المتحرك، ثم اقسم الكتلة على كثافة الميثانول لحساب حجم الطور المتحرك الذي تم جمعه من كل منفذ. وأخيرًا، حدد معدل التدفق إلى كاشف MS واحسب نسب التدفق لجميع الكواشف كنسبة مئوية من إجمالي التدفق كما هو موضح في البروتوكول النصي. إذا انحرفت نسب التدفق بشكل كبير عن القيم المثالية، أضف أنابيب إضافية عند الضرورة لضبط الضغط العكسي، ثم كرر عملية الجمع والحساب.

أخيرًا، اضبط معدل تدفق مضخة كاشف جذر DPPH ليتطابق مع معدل تدفق المنفذ الخارجي المتصل بالكاشف. تم إجراء تحليل HPLC متعدد على عينة من القهوة. تتيح القدرة على تسجيل كروماتوغرامات UV و MS لجذر DPPH في آن واحد مطابقة المركبات الموجودة في العينة والتي استجابت إيجابيًا لجذر DPPH بسهولة مع بيانات UV.

وبناءً على محاذاة زمن الاستبقاء للاستجابات الناتجة عن مطياف الكتلة (MS)، حيث تم تسجيل الكتلة الجزيئية للقمة عند ظهور استجابة إيجابية من كاشف التيار الأيوني الكلي (TIC) لمطياف الكتلة (MSS). وتتيح سهولة مطابقة القمم بين عمليات الكشف المختلفة شكلاً سريعاً وأكثر كفاءة من الفرز والتوصيف لعينة معقدة مثل القهوة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إعدادها في غضون ساعة واحدة تقريباً وتصبح جاهزة لتحليل العينة باتباع هذا الإجراء. كما يمكن استخدام كاشفات أخرى مثل كاشف معامل الانكسار والفلورة، والكشف القائم على التفاعلات الكيميائية مثل التلألؤ الكيميائي، وذلك للحصول على معلومات إضافية عن العينة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تدرك أهمية عمليات الكشف متعددة الإرسال (multiplexing) لتحقيق فهم أعمق للعينة المعقدة. علاوة على ذلك، يعد الكشف المتعدد باستخدام أعمدة التدفق المجزأة المتوازية طريقة فعالة للغاية لإجراء الاستكشاف الحيوي.