التصوير الهياكل التحت خلوية في الأجنة الحية اسماك الزرد

الهدف العام من طريقة التصوير هذه هو دراسة العضيات تحت الخلوية في الفقاريات في الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلايا العصبية ، مثل ديناميكيات الميتوكوندريا ، أو الجسيمات المركزية في سياق في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراء التجربة بأكملها في فقاريات سليمة ، دون الحاجة إلى أي إجراء جراحي.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة ليس فقط للديناميكيات تحت الخلوية في ظل الظروف الفسيولوجية ، ولكن يمكن أيضا تطبيقها على دراسات نماذج الأطروحات ، مثل مرض الزهايمر. بعد توليد أجنة معبرة بشكل عابر عن طريق الحقن المجهري ، أو الحصول على أجنة من خطوط معدلة وراثيا مستقرة ، وفقا لبروتوكول النص ، في نهاية اليوم الأول ، قم بفحص البويضات الميتة أو غير المخصبة. باستخدام ماصة نقل بلاستيكية ، انقل الأجنة القابلة للحياة إلى محلول دانيو الذي يحتوي على 1x PTU لمنع تكوين الصباغ ، والحفاظ على الأجنة في محلول دانيو الذي يحتوي على 1x PTU حتى فحص التعبير الجيني المعدل وراثيا.

في يوم تجربة التصوير ، استخدم مجهر تشريح فلوري لفحص الأجنة المخدرة للتعبير عن الجينات المعدلة وراثيا. ثم انقل الأجنة المختارة إلى طبق بتري منفصل يحتوي على عازلة دانيو مع 1x PTU و 1x tricaine. بمجرد تخدير الأجنة ، قم بتقطيع القليل منها برفق في الاغاروز منخفض الذوبان الذي يحتوي على 1x PTU و 1x tricaine ، مع نقل أقل قدر ممكن من السائل لتجنب تخفيف الاغاروز.

انقل الأجنة بكمية صغيرة من الاغاروز إلى طبق بتري زجاجي القاع. بعد ذلك ، عند العمل بسرعة نسبيا ، استخدم الملقط لوضع الأجنة في الاتجاه المطلوب اعتمادا على الهيكل المراد تصويره. يجب توجيه الأجنة بشكل صحيح على سبيل المثال ، مسطحة على الجانب لتصوير شبكية العين أو الخلايا العصبية Rohon-Beard.

سيضمن الاتجاه الدقيق أفضل جودة للتصوير وتحسين سرعة الاستحواذ. بعد السماح للأغروز بالتصلب لمدة 15 دقيقة على الأقل ، أضف عازلة دانيو مع 1x PTU و 1x tricaine لتغطية الأجنة. لإجراء فحص مجهري واسع المجال ، بعد موازنة طبق من الأسماك المثبتة في غرفة تسخين عند 28.5 درجة مئوية ، على مسرح المجهر واسع المجال ، واختيار مجال الاهتمام ، افتح برنامج المجهر.

ضمن إضاءة، انقر فوق إعدادات التكوين لتحديد مجموعات المرشحات الصحيحة للطول الموجي محل الاهتمام. ضمن إعدادات الكاميرا، أدخل وقت التعريض الضوئي المطلوب للحصول على صورة مناسبة. بعد ذلك ، اختر هدفا مخروطا طويلا للغمس بالماء ، يتراوح من 40x إلى 100x ، والذي يحتوي على أعلى فتحة عددية ويتم تصحيحه لونيا.

انقر فوق Live لاختيار مجال الرؤية. في حالة الخلايا العصبية RB ، قم بتصوير نقل الميتوكوندريا في المحور العصبي الجذعي ، المنبثق من جسم الخلية أو في الشجرة الطرفية. ثم ، في قائمة ImageJ ، انقر فوق زر التحديد المستطيل وحدد منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار.

وانقر فوق عائد الاستثمار في نافذة المدير الصغير. بعد تحديد عائد الاستثمار للتصوير ، انقر فوق إيقاف وحفظ لتسجيل مورفولوجيا الخلايا العصبية في قناة YFP. لتصوير نقل الميتوكوندريا ، انقر فوق Multi-D Acquisition.

ثم ، في النافذة المسماة Multi-Dimensions Acquisition ، حدد عدد النقاط الزمنية والفاصل الزمني بين النقاط الزمنية. في نافذة الاستحواذ متعدد الأبعاد، انقر فوق القنوات، وأضف الطول الموجي للتصوير وحدد فيه ووقت التعرض. انقر فوق حفظ الصور لحفظ الملفات تلقائيا في المجلد المحدد الموضح في مسار الدليل.

الآن ، انقر فوق الحصول على في الزاوية اليمنى العليا لبدء التصوير بفاصل زمني. بالنسبة للفحص المجهري متحد البؤر ، بعد وضع الأجنة المثبتة في غرفة تسخين عند 28.5 درجة مئوية في المرحلة متحدة البؤر ، افتح برنامج المجهر وانقر على Trans Lamp أو Epi Lamp. بعد ذلك ، عبر نظارات المجهر ، استخدم إما الضوء المنقول أو الفلوري على التوالي لتحديد منطقة الاهتمام.

في نافذة إعداد الاكتساب، تحقق من أن الهدف المختار للتصوير يطابق الهدف الذي يظهر في القائمة المنسدلة للأهداف المتاحة. ثم ، في نافذة التحكم في الحصول على الصور ، انقر فوق زر قائمة الصبغة وحدد الفلوروفورات المناسبة. بدلا من ذلك ، انقر فوق مسار الضوء والأصباغ زر لتعيين المعلمات يدويا.

في نافذة إعداد الاكتساب ، اضبط عامل التكبير/التصغير ونسبة العرض إلى الارتفاع للصورة الممسوحة ضوئيا للحصول على حجم البكسل اللازم لحل الهياكل التي يتم تصويرها بشكل أفضل. اضبط حجم البكسل ليكون حوالي نصف الدقة النظرية للهدف ، وبالتالي اتبع معايير أخذ العينات الخاصة ب Nyquist. لتحديد حجم البكسل لصورة تم الحصول عليها ، في نافذة التحكم في الحصول على الصور ، انقر فوق الزر أنا.

بعد ذلك ، اضبط سرعة المسح على أسرع ما يمكن. ثم ، في نافذة التحكم في اكتساب الصور ، انقر فوق متوسط خط كالمان واضبطه على عامل اثنين أو ثلاثة لتقليل الضوضاء. لتحديد وضع المسح المتسلسل لتصوير الفلوروفورات ذات الأطياف المتداخلة ، انقر فوق تسلسلي وخطي.

ثم اضبط خرج الطاقة لخطوط الليزر ذات الصلة. لمسح المنطقة المحددة باستمرار أثناء ضبط إعدادات الكاشف لكل قناة ، انقر فوق XY Repeat أو Focus x2 أو Focus x4. بعد ذلك، اضبط HV وGain وOffset لكل قناة للحصول على صور تحتوي على أعلى نطاق ديناميكي من القيم الرمادية.

الآن ، اضغط على Control plus H لتصور الصور المكتسبة عبر جدول بحث يحدد وحدات البكسل غير المشبعة باللون الأزرق ، والبكسل المشبع باللون الأحمر ، وكلاهما يجب تجنبه. أعد تقييم خرج الطاقة لخطوط الليزر ذات الصلة وإعدادات الكاشف. لتحديد الحدود العليا والدنيا لوحدة التخزين المراد تصويرها ، في إعداد الاكتساب ، انقر فوق الزر إنهاء المجموعة في الحد الأعلى ثم ركز على الحد الأدنى واضغط على بدء الضبط.

للتحقق من دقة Z للهدف ، في التحكم في الحصول على الصور ، انقر فوق الرمز I. ثم حدد حجم خطوة يمثل نصف دقة Z للهدف المحدد. في النافذة الفرعية TimeScan ، أدخل التردد الذي يجب أن يتم عنده الحصول على مكدسات Z ، وعدد المرات التي يجب فيها الحصول على الصور ، لإعداد سلسلة زمنية مناسبة لديناميكيات البنية تحت الخلوية المراد تصويرها.

انقر فوق أزرار العمق والوقت لتأكيد أنه سيتم الحصول على المكدس Z والسلسلة الزمنية. أخيرا ، انقر فوق XY Zt زر لبدء الحصول على صور الفاصل الزمني. بعد الحصول على الصورة ، على واجهة البرنامج ، انقر فوق تم السلسلة.

واحفظ الصور بتنسيق OIB لتسجيل الصور والبيانات الوصفية المرتبطة بها. يوضح هذا الشكل العضيات والخلايا العصبية RB الموجودة على سطح الجنين باستخدام مجالات واسعة وفحص مجهري متحد البؤر. هنا ، تم استخدام التصوير بفاصل زمني على مجهر مجال واسع لتتبع حركة الميتوكوندريوم الفردي في الشجرة المحيطية لخلية عصبية RB.

التصوير متحد البؤر أبطأ بكثير ويمكن أن يؤدي إلى التقليل من ديناميكيات أحداث دون خلوية معينة. تعاني صور خلايا الشبكية المكتسبة عن طريق الفحص المجهري واسع المجال من ضعف التباين ، حيث تحجب إشارات الفلورسنت من حجم كبير من الأنسجة التفاصيل في المستوى البؤري. هنا ، تعمل قدرة التقسيم البصري للفحص المجهري متحد البؤر على تحسين التباين بشكل ملحوظ.

تظهر الأجزاء الداخلية تفاصيل منطقة من الطبقة النووية الداخلية ، مع وضع علامات على الأغشية الخلوية والميتوكوندريا. مدفوعا بمحرك Gau-4 المحدد للخلايا العصبية الحسية ، يسمح التعبير الفسيفسائي من حقن UAS-mito-CFP و UAS MAY-FP بتتبع الخلايا الفردية على مدار أيام ، كما هو موضح في هذه الخلايا العصبية الحسية R-B بعد يومين وثلاثة أيام من الإخصاب. بالإضافة إلى الميتوكوندريا ، يمكن تصنيف العضيات الخلوية الأخرى مثل الجسيمات المركزية بالفلورسنت.

في هذا المثال ، أدى كاسيتان للطائرات بدون طيار على بنية واحدة متجاورة إلى التعبير عن YFP المستهدف للجسيم المركزي ، والسيرول المستهدف بالغشاء في خلايا الشبكية. تظهر الأجزاء الداخلية خلية في المرحلة M. يتطلب هذا الإجراء بأكمله عدة أيام من التزاوج وجمع البويضات والحقن ثم التصوير أخيرا بعد ثلاثة أو أربعة أيام من الإخصاب.

يمكن أن تستغرق تجربة التصوير الفعلية على المجهر عدة دقائق إلى يوم كامل. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تسمية العضيات الأخرى مثل الأنابيب الدقيقة أو البيروكسيسومات وتصويرها من أجل فهم ديناميكيتها في الجسم الحي. لا تنس أن PTU مادة مسرطنة ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.