إعداد Thermoresponsive ذات البنية النانومترية السطوح للهندسة الأنسجة

يتمثل الهدف العام من طريقة لانجموير-شيفير (Langmuir-Schaefer) هذه باستخدام البوليمرات المشتركة الكتلية في تصنيع رقائق خلوية تحت ظروف متنوعة من السطح المستجيب للحرارة، وذلك عن طريق التحكم في قوة التصاق الخلايا وارتباطها. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال المواد الحيوية، مثل المواد المتوافقة حيوياً، وأسطح استزراع الخلايا، والفصل الحيوي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية التحكم في التفاعل بين السطح المستجيب للحرارة والخلايا، وتحسين ظروف التعديل لاستعادة الرقائق الخلوية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول التفاعل بين الخلية والسطح، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل الفصل الحيوي والغشاء الحيوي. للبدء، قم بإذابة الستيرين وECT وACVA في 40 milliliters من 1, 4-Dioxane. جمد المحلول في النيتروجين السائل تحت تفريغ لمدة تتراوح من 15 إلى 20 دقيقة لإزالة الأنواع التفاعلية.

بعد إذابة المحلول تدريجياً في درجة حرارة الغرفة، كرر دورة التجميد والضخ والإذابة وتفريغ الغاز ثلاث مرات. يتم الحصول على البولي ستيرين كعامل macro-RAFT عن طريق البلمرة عند 70 درجة Celsius لمدة 15 ساعة في حمام زيتي. يتم ترسيب عامل macro-RAFT البولي ستيرين باستخدام 800 milliliters من الإيثر، ثم يُجفف تحت تفريغ هوائي.

بعد ذلك، قم بإذابة مونومر IPAAm، وعامل polystyrene macro-RAFT، و ACVA في أربعة ملليلتر من 1, 4-Dioxane. قم بإزالة الأكسجين من المحلول باستخدام دورات إزالة الغاز بالتجميد والضخ والإذابة كما سبق. أجْرِ عملية البلمرة عند 70 درجة مئوية لمدة 15 ساعة في حمام زيتي بعد إزالة الغاز.

أخيرًا، يتم الحصول على جزيء St-IPAAm المُصنّع بنفس طريقة تحضير عامل polystyrene macro-RAFT. اغسل الركائز الزجاجية بكمية وافرة من الأسيتون والإيثانول، ثم استخدم جهاز الموجات فوق الصوتية (sonicate) لمدة خمس دقائق لإزالة الملوثات السطحية. جفف الركائز في فرن عند درجة حرارة 65 °C لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، استخدم بلازما الأكسجين لتنشيط أسطح الركائز في درجة حرارة الغرفة. اغمر الركائز في التولوين الذي يحتوي على 1% من hexatrimethoxysilane طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لإجراء عملية السيلنة للركيزة. ثم اغسل الركائز التي تمت سيلنتها في التولوين واغمرها في الأسيتون لمدة 30 دقيقة لإزالة العوامل غير المتفاعلة.

قم بتلدين الركائز لمدة ساعتين عند 110 درجة مئوية لتثبيت السطح تماماً. وأخيراً، قم بقص الركائز التي تمت معالجتها بالسيلان باستخدام قاطع زجاجي إلى مقاس 25 مم في 24 مم لتتناسب مع أطباق زراعة الخلايا. ضع جهاز غشاء لانغموير في خزانة لمنع تراكم الغبار.

اغسل حوض لانغموير مع الحواجز بالماء المقطر والإيثانول لإزالة الملوثات. جفف الحوض والحواجز عن طريق المسح بمنشفة خالية من الوبر. ثم املأ الحوض بنحو 110 milliliters من الماء المقطر، وثبت الحواجز على جانبي الحوض.

بعد ذلك، يتم تسخين صفيحة ويلمهيم البلاتينية المستخدمة لمراقبة التوتر السطحي باستخدام موقد غاز حتى تتحول الصفيحة إلى اللون الأحمر. ثم تُغسل الصفيحة بالماء المقطر لإزالة الملوثات. تُعلق صفيحة ويلمهيم بواسطة سلك متصل بجهاز قياس الضغط السطحي.

قم بتصفير جهاز قياس ضغط السطح وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. قم بضغط الواجهة البينية بين الهواء والماء في الحوض باستخدام الحواجز الموجودة على كلا جانبي الحوض حتى تصل مساحة الواجهة إلى 50 سنتيمتراً مربعاً تقريباً دون وجود أي قطرات من البوليمر. اسحب أي ملوثات صغيرة حتى يقترب ضغط السطح من صفر ملي نيوتن لكل متر.

أعد وضع الحواجز على كلا الجانبين، وأضف الماء المقطر لتعويض النقص في كمية الماء المقطر. بعد ذلك، أذب خمسة مليغرامات من جزيء St-IPAAm المُصنّع في خمسة مليليترات من محلول تطوير مكون من الكلوروفورم. ثم، قم بتقطير 27 ميكرولتر من St-IPAAm المذاب في الكلوروفورم برفق فوق الحوض باستخدام سرنجة دقيقة أو ماصة دقيقة.

بعد الانتظار لمدة خمس دقائق للسماح بتبخر الكلوروفورم تماماً، يتم تحريك كلا الحاجزين أفقياً لضغط جزيء St-IPAAm عند السطح. حافظ على معدل ضغط الحواجز عند 0.5 millimeters per second حتى الوصول إلى المساحة المستهدفة البالغة 50 square centimeters. قم بقياس نظائر الضغط السطحي Pi-A باستخدام صفيحة ويلヘルمي البلاتينية المتصلة بجهاز قياس الضغط السطحي أثناء عملية الضغط، وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة.

بعد الوصول إلى حجم المنطقة المستهدفة، حافظ على السطح لمدة خمس دقائق للسماح لجزيئات St-IPAAm بالاسترخاء؛ حيث إن الجزيئات لا تصل إلى حالة التوازن فوراً بعد الضغط. بعد ذلك، انقل غشاء لانجموير إلى ركيزة زجاجية معدلة كارهة للماء باستخدام جهاز نقل لمدة خمس دقائق لامتصاص الغشاء بشكل قوي.

ثبّت الركيزة الزجاجية الكارهة للماء بشكل متوازٍ على الجهاز. صِل الجهاز بمنصة محاذاة وحرّكه بشكل عمودي. ارفع الركيزة أفقياً باستخدام جهاز النقل وجففها لمدة يوم واحد في مجفف.

لتحضير معلقات خلوية، يتم استنبات خلايا بطانية من الشريان السباتي البقري، أو BAECs، حتى تصل إلى ثلث التلاقي (1/3 confluence) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في بيئة تحتوي على 5%CO2 و95% هواء، وذلك على بوليستيرين لزراعة الأنسجة باستخدام وسط DMEM، الذي يحتوي على FBS وبنسلين. بعد الوصول إلى التلاقي، تُعالج خلايا BAECs بثلاثة ملليلتر من 0.25%trypsin EDTA لمدة ثلاث دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في بيئة تحتوي على 5%CO2 و95% هواء. يتم إيقاف مفعول trypsin EDTA بإضافة 10 ملليلتر من وسط DMEM الذي يحتوي على 10%FBS.

ثم اجمع معلق الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 50 مللتر. بعد الطرد المركزي عند 120 ×g لمدة خمس دقائق، اشفط الراشح وأعد تعليق الخلايا في 10 مللتر من وسط DMEM. ازرع الخلايا المستعادة على أسطح St-IPAAm بتركيز 10,000 خلية لكل سنتيمتر مربع، ويتم عدها باستخدام مقياس خلايا (hemocytometer) قابل للتخلص.

افحص الخلايا الموجودة على الأسطح باستخدام مجهر مجهز بحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5%CO2 و95% هواء. بعد ذلك، قم بتعقيم أسطح St-IPAAm باستخدام ضوء فوق بنفسجي مثبت في كبينة تعقيم (clean bench). سجل صوراً بنظام الفاصل الزمني (timelapse) لخلايا BAECs الملتصقة لمدة 24.5 ساعة تقريباً عند درجة حرارة 37 درجة مئوية باستخدام مجهر تباين الأطوار بقوة تكبير 10x.

بعد التصاق خلايا BAEC، سجل عملية انفصال خلايا BAECs عن سطح St-IPAAm عند درجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة 3.5 ساعة تقريباً. بعد تحسين عملية التصاق الخلايا وانفصالها على السطح المنقول من فيلم لانجميور، قم بتصنيع الصفائح الخلوية عن طريق زراعة خلايا BAECs أولاً كما سبق. ازرع ما مجموعه 100,000 خلية لكل سنتيمتر مربع على أسطح St-IPAAm.

ثم يتم التحضين لمدة ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية في 5%CO2. تنفصل خلايا BAECs المتلاحمة تلقائياً عند 20 درجة مئوية. يظهر هنا تحضير سطح منقول من فيلم لانجمير المستجيب للحرارة.

تم تقطير محلول St-IPAAm المصنع في الكلوروفورم برفق على سطح فاصل بين الهواء والماء. استُخدم حاجزان لضغط جزيئات St-IPAAm على السطح الفاصل حتى الوصول إلى المساحة المستهدفة البالغة 50 سنتيمتر مربع. وتم قياس الضغط السطحي أثناء عملية الضغط للكشف عن أي عيوب في فيلم لانجميور (Langmuir film).

بعد الضغط، وُضعت ركيزة زجاجية غطائية معدلة كارهة للماء أفقيًا على السطح البيني باستخدام منصة محاذاة. ثم رُفعت الركيزة أفقيًا وجُففت لمدة يوم واحد. بعد هذه الخطوة، أصبحت أسطح St-IPAAm جاهزة للاستخدام في تجارب زراعة الخلايا.

تظهر هنا النتائج الممثلة لصور التضاريس المأخوذة بمجهر القوة الذرية لأسطح St-IPAAm. وقد لوحظ وجود بنى نانوية على كلا سطحي St-IPAAm. كما اعتمد حجم وشكل هذه البنى النانوية بشكل كبير على AM وتركيبة St-IPAAm.

تظهر هنا صورة عيانية لرقاقة خلوية مستعادة على سطح منقول من فيلم لانجموير باستخدام St-IPAAm 480، وبمساحة جزيئية (AM) تبلغ 40 نانومتر مربع لكل جزيء. وصلت الخلايا إلى مرحلة التلاقي بعد ثلاثة أيام من الزرع على أسطح St-IPAAm 170 و St-IPAAm 480 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. وقد استُعيدت الرقاقة الخلوية بسرعة بعد خفض درجة الحرارة من 37 إلى 20 درجة مئوية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التصنيع، وكيفية تصميم التركيب الجزيئي للبوليمر، وتصنيع ونقل فيلم لانجمير (Langmuir film)، والتحكم في التصاق الخلايا وانفصالها، واستعادة الصفائح الخلوية. يمهد هذا الأسلوب، بعد تطويره، الطريق للباحثين في مجال المواد الحيوية وهندسة الأنسجة لاستكشاف التفاعلات بين الخلايا والأسطح واستراتيجيات زراعة الخلايا لاستخدامها في الطب التجديدي. وتمتد تطبيقات هذه التقنية نحو علاج زراعة الخلايا، لأن هذه التقنية تمتلك القدرة على تصنيع صفائح خلوية من أنواع مختلفة من الخلايا يتم توفيرها من المرضى.