سريع الهواء الجاف اسقاط كروموسوم طريقة التحضير مناسبة لFISH في النباتات

الهدف العام من هذه الطريقة هو تحضير كروموسومات نباتية مناسبة للتألق في تقنية التهجين C الثانية باستخدام مجسات الحمض النووي أحادية النسخة وعالية النسخة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الوراثة الخلوية وأبحاث الجينوم ، مثل الكشف عن إعادة ترتيب الكروموسومات ، وترتيب العلامات الجينية على الكروموسومات ، والتحليل المقارن بين الأنواع المختلفة. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي أن تحضير انتشار الكروموسوم يصبح سريعا وسهلا وفعالا.

يمكن تخزين تعليق الخلية عند درجة حرارة 20 درجة تحت الصفر حتى شهرين واستخدامه لتحضير الكروموسوم عند الحاجة. خطرت لنا هذه الفكرة لأول مرة عن هذه الطريقة عندما لاحظنا أن جودة وعدد الكروموسومات المناسبة زادت بشكل كبير هي أيام الإنسان إنبت 10 إلى 20 بذرة شعير على طبقتين من ورق الترشيح الرطب في طبق بتري في ظروف مظلمة لمدة يومين عند 22 إلى 24 درجة مئوية بعد يومين. قطع الجذور القوية بأطوال من سنتيمتر إلى سنتيمترين من البذرة باستخدام شفرة حلاقة.

بعد ذلك ، قم بإعداد الماء المثلج عن طريق وضع زجاجة زجاجية سعة 500 مل تحتوي على ماء الصنبور البارد في الماء المثلج المجروش. قم بتهوية الماء المثلج واغمر أطراف الجذر لمدة 20 ساعة لزيادة تواتر خلايا الطور. انقل الجذور من الماء إلى 50 مل من مثبت حمض الخليك الإيثانول لإصلاحها في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين بعد التثبيت.

اغسل 10 إلى 20 جذرا ب 30 مل من ماء الصنبور المثلج في مكبر صوت زجاجي سعة 50 مليلتر لمدة خمس دقائق مرتين. انقل الجذور واحدة تلو الأخرى إلى 30 مل من عازلة السترات باستخدام الملقط. اغسل الجذور عن طريق هز السماعة الزجاجية لمدة خمس دقائق مرتين.

ثم ضع الجذور على ورق ترشيح لإزالة السائل تماما تحت المجهر. اقطع الأنسجة غير الميريستيمية غير المرغوب فيها باستخدام شفرة حلاقة. تتمثل الخطوة الأكثر أهمية في هذا الإجراء في تحديد وقت الهضم المناسب الذي قد يختلف بين الأنواع المختلفة.

هنا يتم تحضين ما يصل إلى 20 طرفا جذريا في مليلتر واحد من خليط الإنزيم عند 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة تقريبا. لتليين الأنسجة النباتية في زجاج الساعة تحت المجهر ، قم بإزالة الإنزيم عن طريق سحب العينات واغسل أطراف الجذر على الجليد بخمسة ملليلتر من 0.01 مولار سيترات عازلة لتحل محل الإنزيم المتبقي. استمر في غسل أطراف الجذر بمليلتر واحد من 96٪ من الإيثانول مرتين بعناية في نفس زجاج الساعة.

ثم استبدل الإيثانول ب 10 إلى 15 ميكرولتر من المثبت الطازج لكل طرف جذر. انقل أطراف الجذر مع المثبت إلى أنبوب ملليلتر وتفكك جذر سيقان الجذر بإبرة تشريح أو ملقط. اضغط على الأنبوب 20 مرة لإعادة تعليق الخلايا والحصول على تعليق الخلية.

بعد ذلك ، ضع طبقتين إلى ثلاث طبقات من المناديل الورقية المبللة بالماء على طبق ساخن عند 50 درجة مئوية. اغمر الشرائح المجهرية في الثلج وماء الصنبور البارد في الثلاجة لمدة 30 دقيقة. ثم ضع الشرائح فوق المناديل الورقية الرطبة ، وقم بسحب سبعة إلى 10 ميكرولترات من تعليق الخلية ، وقم بإسقاطها من مسافة 20 سم على الشريحة المبردة الموضوعة على اللوحة الساخنة.

اتبع ذلك مع 10 ميكرولترات من خليط الإيثانول بحمض الأسيتيك في نفس مكان تعليق الخلية على الشريحة ، واحتفظ بالشريحة على اللوحة الساخنة. بعد دقيقتين ، ضع الشريحة على اللوحة الساخنة بدون منديل مبلل واتركها تجف لمدة دقيقة إضافية. تحقق من الشرائح باستخدام مجهر تباين الوجه للتحكم في جودة انتشار الكروموسوم.

استخدم الشرائح إما في نفس اليوم أو قم بتخزينها عن طريق غمرها في 96٪ من الإيثانول في وعاء كوبلين عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمعالجة الشرائح قبل السمك. ضع الشرائح في وعاء يحتوي على 50 مل من اثنين من XSSC لمدة خمس دقائق باستخدام ملقط. انقل الشرائح إلى برطمان coplan يحتوي على 50 مل من 45٪ حمض الأسيتيك لمدة ثلاث إلى 10 دقائق.

بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى جرة coplan تحتوي على 50 مل من اثنين من XSSC لمدة 10 دقائق. ثم انقل الشرائح إلى وعاء كوبلين يحتوي على 50 مل من 4٪ فورمالديهايد ، واغمر الشرائح لمدة 10 دقائق لإصلاح الكروموسومات. قم بإزالة الفورمالديهايد عن طريق شطف الشرائح ثلاث مرات لمدة أربع دقائق لكل منها في وعاء كوبلن يحتوي على 50 مل من اثنين من XSSC.

ثم قم بتجفيف الشرائح لمدة دقيقتين في سلسلة من 70٪ 90٪ و 100٪ من الإيثانول ، وجفف الشرائح في وضع رأسي. لكل شريحة ، قم بإعداد محلول تهجين من 20 ميكرولتر باستخدام 10 ميكرولترات من أميد الشكل منزوع الأيونات خمسة ميكرولترات من أربعة مخزن مؤقت للتهجين X ، وثلاثة ميكرولترات من المسبار وميكرولترين من الماء الحر Dns. أضف 20 ميكرولترا من محلول التهجين لكل شريحة وقم بتغطيتها بزلة غطاء 24 × 32 ملم.

بعد إغلاق زلة الغطاء بشرائح تشويه طبيعة الأسمنت المطاطي مع مجسات في وقت واحد عند 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين على لوح ساخن ، انقل الشرائح إلى غرفة رطبة واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل. لتجنب الضوء ، قم بإزالة زلات الغطاء عن طريق شطف الشرائح في وعاء اقتران باستخدام اثنين من XSSC. ثم ضع الشرائح في وعاء مشترك يحتوي على 55 إلى 60 درجة مئوية ، واثنين من XSSC واحتضانها لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، ضع الشرائح في قطعتين من XSSC في وعاء coplan لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. واثق. جفف الشرائح في وعاء مشترك لمدة دقيقتين في سلسلة من 70٪ 90٪ و 100٪ إيثانول. هواء. جفف الشرائح وقم بإزالة البقع المضادة باستخدام dappy في وسط تركيب Antifa ، وتجنب الضوء الشديد.

قم بتحليل الشرائح باستخدام مجهر مضان epi. يعتمد اختيار المرشح على الفلوروكروم المستخدم في وضع العلامات على المسبار إذا لزم الأمر. قم بتخزين الشرائح عند أربع درجات مئوية في ظل ظروف مظلمة تصل إلى عام.

عرض انتشاءات الطور الانقسامي المحضرة بطريقة تحضير الكروموسوم سريع الجفاف في الهواء هنا. تم إجراء تحليل الأسماك باستخدام كل من التسلسلات المتكررة والنسخة الواحدة. تم الحصول على الصور بواسطة مجهر مضان epi مع مجموعة من المرشحات التي تتيح إثارة الفلورو المقابل والتقاطها بواسطة كاميرا أحادية اللون CCD عالية الحساسية.

كشفت تجربة الأسماك على كروموسومات الطور الانقسامي للكنز والفولغاري باستخدام مسبار أحادي النسخة وخمسة S-R-D-N-A عن إشارات مميزة وعالية الجودة. أدى تهجين القمر الصناعي الصغير CTT 10 على كروموسومات هوردي و BULBUS إلى نمط محدد ومتميز. أسفرت تجربة الأسماك على كروموسومات الطور الانقسامي لسلسلة سالا باستخدام مسبار PSC 119 عن إشارات محددة وعالية الجودة.

الفوائد الواضحة لهذا النهج هي الانتشار الجيد وغير التالفة والعديد من الكروموسومات metaphase التي تعمل كشرط أساسي مثالي لتحليل الأسماك الناجح. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء هذا الإجراء في أقل من ساعتين إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد مساحة كروموسوم الوجه الانقسامي عالية الجودة للأسماك IDE والسابقة ، يمكن أن يكون الارتفاع خطيرا للغاية ، ودائما استخدام الرسوم البيانية وغطاء الفيلم عند تنفيذ هذه الإجراءات.