الخلايا الجذعية مثل

الهدف العام من هذا البروتوكول هو استخدام مستنبتات سقف التجويف الأريمي أو القبعة الحيوانية لـ x laevis لاختبار الآليات الجزيئية والعمليات الخلوية الكامنة وراء التطور العصبي في المختبر وفي الجسم الحي. يمكن لهذه الطرق أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات بيولوجيا التطور وبيولوجيا الخلايا الجذعية حول اكتساب المصير، وهجرة الخلايا، والخصائص الذاتية وغير الذاتية للخلايا العصبية. توفر التقنيات المعروضة أدوات بسيطة ورخيصة ومتعددة الاستخدامات وفعالة لاستكشاف الآلية الأساسية لسلوكيات الخلايا العصبية الرئيسية.

تسمح هذه المقايسات باختبار محددات المصير العصبي لإعادة برمجة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات، والتوليد الناضج للسلالات الخلوية المشتقة عصبيًا لغرض الفرز الإضافي. وبشكل عام، سيواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن التقنيات تتطلب مهارة يدوية. لقد خطرت لي الفكرة الأولى لهذه الطرق عندما كنت أفكر في تحليل سلوك الفصل الخلوي.

لتثبيت الأنبوب العصبي الأمامي لجنين *Xenopus laevis* بشكل مسطح، استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل جنين مُثبَّت ومجفف ثم أعيد ترطيبه إلى طبق بتري سعة 60 مليمتر مملوء بالكامل بمحلول PBT. بعد ذلك، أدخل ملقطاً دقيقاً بين العينين والأنبوب العصبي عند مستوى السويقة البصرية وقم بفصل العينين. ثم أدخل الملقط بعناية تحت الأديم الظاهر الذي يغطي الأنبوب العصبي خلف الرأس وقم بتقشير الأديم الظاهر بعناية.

بعد إجراء عملية وسم التهجين المناسبة لـ NC2، انقل الجنين إلى طبق بتري جديد سعة 60 ملليلتر مملوء بـ PBT، واستخدم ملقطاً دقيقاً لعزل الأنبوب العصبي الأمامي من الجنين بشكل عام. بعد ذلك، قم بإزالة الحبل الظهري الملتصق بشكل فضفاض بعناية من أسفل الأنبوب العصبي. وإذا لزم الأمر، قم بإزالة الحويصلات الأذنية والأجزاء المتبقية من الميزوديرم.

بعد قطع جميع زوائد الأنبوب العصبي، افصل الأنبوب العصبي الأمامي عن الجنين. ثم انقل الأنبوب العصبي المعزول إلى أنبوب مخروطي سعة 1.5 milliliter مملوء بـ 50%glycerol و PBS للمعالجة طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. وبعد معالجة ثانية طوال الليل في 90%glycerol، انقل الأنبوب العصبي إلى شريحة مجهرية في كمية صغيرة من glycerol واستخدم إبر Tungsten لتشريح الأنابيب العصبية على طول الخطوط المتوسطة الظهرية والبطنية.

بعد ذلك، استخدم حلقات تدعيم مغطاة بشريحة غطاء زجاجية لتثبيت جانبي الأنبوب العصبي في 90% glycerol و PBS. ولتحضير الخرزات لتحفيز مستأصل القبعة الحيوانية، استخدم ماصة دقيقة P200 لنقل نصف كمية من خرزات الراتنج المعالجة بـ BSA إلى أنبوب جديد سعة 1.5 milliliter. ثم، استبدل الماء المقطر المعقم في الأنبوب الجديد بـ 200 microliters من الوسط الذي يحتوي على الجزيء التجريبي محل الدراسة لمدة ساعتين عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

في نهاية فترة التحضين، يتم نقل أجنة مرحلة البلاستولا أو مرحلة بداية الجاسترولا المبكرة جداً إلى محلول PBS مضاف إليه الكالسيوم والمغنيسيوم ومُدعم بـ 0.2%BSA. بعد ذلك، وباستخدام مجهر ستيريو، يتم قرص الغشاء المحي (vitelline membrane) بجانب زوج من الملاقط، واستخدام زوج ثانٍ من الملاقط لتقشير الغشاء ببطء من الجانب النباتي للجنين مع الحرص على عدم إتلاف الجانب الحيواني. ثم، وباستخدام ملاقط دقيقة، يتم قطع مربع صغير من القطب الحيواني لكل جنين.

باستخدام رأس ماصة مطلي بـ BSA، انقل الأغطية إلى آبار فردية في لوحة Terasaki متعددة الآبار تحتوي على 0.5X modified Barth's saline، مع وضع الجانب الملون للحيوان في تلامس مع القاع المستدير للبئر. وباستخدام ماصة دقيقة P20، اختر الخرزات ذات اللون الوردي الأكثر دكنة من أنبوب المعالجة وضع خرزة واحدة على كل غطاء، مع استخدام ملاقط لتوسيط الخرزات فوق الأغطية. وعند وضع الخرزة الأخيرة، ضع اللوحة فوق أوراق مبللة بالماء وغطِّ اللوحة بحاوية بلاستيكية قبل البدء في عملية الحضن.

لتحضير مستنبتات القمة الحيوانية المفككة والمعاد تجميعها، اعزل من 15 إلى 30 قمة حيوانية كما تم توضيحه للتو. استخدم ملقطاً دقيقاً لقص مربع صغير من النسيج من الأقطاب الحيوانية. انقل القمم الحيوانية إلى بئر مغطى بالأجاروز ومملوء بمحلول Holtfreter الملحي الخالي من الكالسيوم، بحيث تكون جوانبها الملونة متجهة للأعلى.

بعد بضع دقائق، ينبغي ملاحظة حدوث التفكك. استخدم ملقطاً دقيقاً لفصل الطبقات المصبوغة عن بقية النسيج. ومن ثم، استخدم ماصة دقيقة P20 للتخلص من الصبغة.

عندما تتم إزالة معظم الطبقات المصبغة وتنفصل الخلايا تماماً، قم بتدوير الطبق لتجميع الخلايا في المركز واستخدم ماصّة دقيقة P1000 لإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط، مع الحرص على عدم لمس الخلايا. بعد ذلك، أضف واحد مللي لتر من محلول ملحي Holtfreter مع الكالسيوم إلى الفجوة. انقل القبعات الحيوانية المنفصلة إلى أنبوب سعة 1.5 مللي لتر.

بعد تدوير الخلايا بالطرد المركزي، استخدم ماصة دقيقة P1000 لإزالة السائل الطافي بعناية، ثم أعد تعليق الرواسب في 20 µL من محلول Holtfreter الملحي مع الكالسيوم. اترك الخلايا لتعود إلى التجمع لمدة تتراوح من ثلاث إلى ست ساعات في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف ببطء 1 mL من 3/4 NAM لفصل المستنبتات بعناية عن قاع الأنبوب، واستخدم ماصة نقل بلاستيكية لتوزيع المستنبتات في أطباق فردية غير مطلية.

لزراعة مستأصلات الغطاء الحيواني على الصفائح العصبية لضفدع Xenopus laevis، ابدأ بطلاء أطباق بتري بقطر 60 مليمتر بآغاروز بتركيز 3% ومحلول NAM بنسبة 3/4، مع عمل ثقوب صغيرة فيها. بعد ذلك، انقل أجنة مرحلة neurula المبكرة إلى محلول PBS يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم ومدعم بـ BSA بتركيز 0.2% لإزالة الغشاء المحي. ثم املأ طبق التشريح المطلي بالآغاروز بمحلول NAM طازج بنسبة 3/4، وانقل الأجنة إلى طبق التشريح بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى.

الآن، انقل مستنبت غطاء حيواني مُعاد تجميعه إلى طبق التشريح، مع السماح للمستنبت بالهبوط ببطء في الطبق بفعل الجاذبية بمجرد أن يخترق طرف الماصة سطح وسط NAM. بعد ذلك، وباستخدام مجهر ستيريو، استخدم ملقطاً مستديراً لتثبيت الجنين في مكانه بينما تستخدم إبرة تنجستن لإجراء شق في الصفيحة العصبية لوضع المستنبت. استأصل قطعة صغيرة من مستنبت الغطاء الحيواني المُعاد تجميعه باستخدام الملقط المستدير وسكين حواجب.

استخدم قطعة النسيج لتحديد حجم قطعة المستنبت لعملية الطعم. يوضح هذا الشكل الأنابيب العصبية الأمامية لـ X laevis و X tropicalis مثبتة بشكل مسطح كما تم توضيحه للتو في المراحل 30 و32 و35 بعد التهجين المزدوج NC2 للتركيب الكامل. وكما لوحظ في هذه الصور، يتم الكشف عن تعبير xenopus sonic hedgehog في الخلايا الملامسة للخرز المنقوع في وسط مكيف مدعم بالنهاية الطرفية لجين sonic hedgehog، ولكن ليس في الخلايا الملامسة للخرز المعالج بوسط تحكم.

بعد عملية التفكيك وإعادة التجميع كما تم توضيحه للتو، خُلطت هذه المستنبتات التي تحتوي على خلايا القبعة الحيوانية الأمامية مع خلايا قبعة حيوانية أمامية تعبر عن Otx2. وكما لوحظ، فإن الخلايا التي تعبر عن Otx2 لم تنفصل عن الخلايا التي لا تعبر عنه، بل اختلط كلا النوعين من الخلايا بحرية في جميع أنحاء المستنبت.

على النقيض من ذلك، في المستنبتات التي خُلِطت فيها الخلايا المعبرة عن Otx2 مع الخلايا المعبرة عن BAR HL-2 وIRX3، شكلت الخلايا المعبرة عن الجينات المتعددة بقعاً متماسكة لم تنتشر بشكل موحد داخل المستنبت المعاد تجميعه. وعندما تم تطعيمها في الصفيحة العصبية الأمامية لأجنة x laevis كما تم توضيحه للتو، أظهرت المستنبتات المختلطة المكونة من خلايا تعبر بشكل مشترك عن BAR HL-2 وOtx2 وIRX3 والمختلطة مع خلايا تعبر عن N-terminus sonic hedgehog تعبيراً داخلياً لـ sonic hedgehog وانفصلت عن الخلايا الظهارية العصبية الأمامية. بينما، عندما تم تطعيم المستنبتات المختلطة المكونة من خلايا تعبر عن Otx2 وN-terminus sonic hedgehog في الصفيحة العصبية لـ x laevis، لم تعبر الخلايا المطعمة عن sonic hedgehog ولم تنفصل عن الخلايا المجاورة لها.

بمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إجراء عملية تطعيم المستأصل من القبعة الحيوانية على الصفائح العصبية الجنينية في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات، وذلك اعتماداً على عدد الأجنة التي يتم تطعيمها. وهي تقنية قوية للغاية ومجزية جداً. وعند محاولة القيام بهذا الإجراء، من المهم توخي الحذر الشديد من التلوث البكتيري والفطري.

بعد إجراءات التطعيم، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التهجين الموضعي للعينة الكاملة (whole mount in situ hybridization) لتتبع مصائر وسلوكيات الخلايا المطعمة. إن البرامج التنموية التي تقوم عليها عملية تكوين أعضاء الأنبوب العصبي محفوظة إلى حد كبير، خاصة في الفقاريات. وبذلك، فإن المعلومات المكتسبة من البرمائيات قد عززت فهمنا للعمليات الخلوية والجزيئية التي تكمن وراء تطور الفقاريات.