عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP
يناير 20, 2016
تحديد الجزيئات المرتبطة بمناطق جينومية محددة ذات أهمية مطلوب لفهم آليات تنظيم وظائف هذه المناطق. يصف هذا البروتوكول إجراءات إجراء عدم الترسب الهندسي للكروماتين بوساطة جزيء ربط الحمض النووي (enChIP) لتحديد البروتينات والحمض النووي الريبي المرتبط بمنطقة جينومية معينة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل منطقة جينومية معينة تحتفظ بالتفاعلات الجزيئية لتحديد الجزيئات التي تتفاعل مع المنطقة الجينومية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة في مجالات الوظائف الجينومية مثل النسخ والتنظيم اللاجيني. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح التعرف المباشر على الجزيئات التي تتفاعل مع منطقة جينومية معينة.
سيوضح الإجراء توشيتسوغو فوجيتا ، أستاذ مساعد من مختبري. باتباع بروتوكول النص ، قم بهندسة جزيئات ربط الحمض النووي ذات الأهمية. يستلزم ذلك إنشاء تسلسل gBlock ذي الأهمية وإدخاله في فيروس قهقري ، على سبيل المثال لإنتاج دليل الحمض النووي الريبي المعقد بثلاثة FLAG-dCas9.
بدلا من ذلك ، يمكن إنشاء ثلاثة بروتينات FLAG-TAL للتعرف على التسلسل المستهدف. ثم, اتباع بروتوكول النص تصيب الخلايا مع الفيروس القهقرية المعدة. تأكيد التعبير عن جزيئات ربط الحمض النووي الهندسية وإنشاء خط الخلية.
الآن ، تابع عن طريق ربط الخلايا بالفورمالديهايد. قم بتعليق 20 مليون خلية منقولة في 30 مل من وسط الزراعة العادية وأضف 810 ميكرولتر من 37٪ فورمالديهايد للحصول على تركيز نهائي قدره 1٪ احتضان الخليط لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد خمس دقائق ، اقتل تفاعل الربط المتقاطع بإضافة 3.1 مل من 1.25 مولار جلايسين.
دع الخلايا تجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل المتابعة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لأنبوب الخلية عند 300 جم لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي مبرد. تخلص بعناية من المادة الطافية واغسل حبيبات الخلية في 30 مل من PBS عن طريق الخلط والطرد المركزي.
قم بإجراء غسلتين PBS. إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين الحبيبات المغسولة للخلايا الثابتة عند سالب 80 درجة مئوية. استمرارا ، اجمع الكروماتين من الخلايا.
قم بتعليقها في 10 مل من محلول التحلل واحتضانها على الجليد لمدة 10 دقائق. ثم ، باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد ، اجمع الخلايا وتخلص من المادة الطافية بعناية. الآن ، قم بتعليق حبيبات الخلية في مخزن التحلل النووي واحتضانها على الجليد لمدة 10 دقائق.
كل بضع دقائق أثناء الحضانة ، قم بدوامة الخليط لفترة وجيزة. مرة أخرى ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. الآن ، اغسل الحبيبات ب 10 مل من PBS وقم بإزالة محلول الغسيل باستخدام جهاز طرد مركزي آخر.
ينتج عن هذا جزء الكروماتين ، وإذا رغبت في ذلك ، يمكن تجميده وتخزينه عند سالب 80 درجة مئوية. استمر في تعليق حبيبات الكروماتين في 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل المعدل ثلاثة ونقل التعليق إلى أنبوب أصغر سعة 1.5 مل. الآن ، قم بتشغيل مسبار صوتنة في المستوى الثالث من الطاقة مع واجب مستمر.
لتجزئة الكروماتين ، قم بتدوير يدويا بين 10 ثوان من الصوتنة و 20 ثانية على الجليد. في كل دورة خامسة أو سادسة ، قم بتمديد مرحلة الجليد إلى دقيقتين حتى لا ترتفع درجة حرارة العينة. قم بإجراء دورة صوتنة هذه من 10 إلى 18 مرة ، مع الحفاظ على طرف المسبار بعيدا عن الجزء السفلي من الأنبوب لتجنب رغوة العينة.
بعد الصوتنة ، اجمع العينة باستخدام الطرد المركزي المبرد السريع. بعد ذلك ، انقل المادة الطافية التي تحتوي على الكروماتين المجزأ إلى أنبوب جديد وتخلص من الحبيبات. راجع بروتوكول النص حول كيفية تقييم التجزئة.
للتحضير للترسيب المناعي ، قم أولا بتوصيل الأجسام المضادة ل Dynabeads. يتم تحجيم هذا الترسيب المناعي إلى عينات مشتقة من 20 مليون خلية. أضف 1/5 حجم من المخزن المؤقت للتحلل المعدل ثلاثة مع Triton X-100 إلى الكروماتين المجزأ للحصول على تركيز نهائي قدره 1٪ تريتون.
بعد ذلك ، أضف الخليط إلى الخرزات المغناطيسية المترافقة مع الماوس العادي IgG. احتضان التفاعل لمدة ساعة على دوار مع التبريد. في وقت لاحق ، اجذب الخرزات من المحلول لمدة ثلاث دقائق على حامل مغناطيسي.
ثم اجمع المادة الطافية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب الخرز المغناطيسي المترافق مع الأجسام المضادة ل FLAG. قم بتشغيل تفاعل الاقتران هذا طوال الليل على دوار عند أربع درجات مئوية.
في صباح اليوم التالي ، ضع مغناطيسا على الأنبوب لمدة ثلاث دقائق لجمع الخرز. ثم قم بإخراج المادة الطافية وتخلص منها. الآن ، اغسل الخرز.
قم بتعليقها في ملليلتر واحد من المحلول المؤقتة منخفضة الملح واحتضانها لمدة خمس دقائق على دوار عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة ، اعزل مغنطة الخرز وتخلص من المادة الطافية. كرر خطوة الغسيل هذه باستخدام محلول منخفض الملح مرة أخرى.
باستخدام نفس التقنية ، قم بإجراء غسلتين أخريين باستخدام عازلة عالية الملح. استمر في استخدام طريقة غسل الخرزات في عازلة كلوريد الليثيوم مرتين. أخيرا ، اغسل الخرزات ب TBS-IGEPAL CA-630 مرة واحدة فقط.
بعد خطوات الغسيل السبع ، قم بتعليق الخرزات في 200 ميكرولتر من محلول الشطف واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، اجذب الخرزات عن طريق المغنطة واجمع المادة الطافية في أنبوب جديد. كرر خطوة الشطف هذه لزيادة الغلة.
ثم قم بتنقية حوالي 5٪ من الحمض النووي لتقدير المحصول. ابدأ بخلط الجزء الأكبر من التحفيص في تفاعل هطول الأمطار. ترسيب الكروماتين بين عشية وضحاها عند سالب 20 درجة مئوية.
في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للعينة وتخلص من المادة الطافية. شطف الحبيبات مع ملليلتر من 70٪ الإيثانول وكرر الطرد المركزي لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية الحبيبات في 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة 2x.
الآن ، قم بدوامة التعليق لمدة خمس دقائق كاملة. ثم قم باحتضانه عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتغيير طبيعة الارتباط المتقاطع وعكسه. بعد الغليان ، قم بتشغيل 40 ميكرولترا من العينة على جل SDS-PAGE.
عادة ما يتم استخدام تدرج من أربعة إلى 20٪. قم بتشغيل الجل حتى تنتقل الصبغة سنتيمترا واحدا تحت البئر. ثم قم بتلطيخ الجل وتقطيعه إلى خمس قطع يبلغ طولها حوالي 2 ملليمتر.
قم بتخفيف البروتين من قطع الجل واستخدامه لتحليل المواصفات الكتلية. يتم تغطية تنقية الحمض النووي الريبي ، متبوعا بتحليل التسلسل ، في بروتوكول النص. بشكل عام ، يمكن تنقية ما يصل إلى 10٪ من المناطق الجينومية المستهدفة باستخدام enChIP.
تظهر هنا عوائد التحليلات التي تستهدف منطقة المحفز لجين IRF-1 مقارنة بموضع Sox2 غير المحدد. مثال آخر هو التيلوميرات المستهدفة مقابل موضع جاما الساتلي غير المحدد. حدد enChIP SILAC العديد من البروتينات المرتبطة بمحفز IRF-1 بطريقة خاصة بالإنترفيرون جاما.
تم تحديد البروتينات المرتبطة بالتيلومير أيضا بواسطة enChIP جنبا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي. ثم تم استخدام تسلسل enChIP RNA لتحديد الحمض النووي الريبي المرتبط بالتيلوميرات. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات النسخ والتنظيم اللاجني لاستكشاف مثل هذه الآليات في مختلف الأنظمة البيولوجية.
نظرة عامة
يحدد هذا البروتوكول تقنية الترسيب المناعي للكروماتين بوساطة الجزيئات المؤتلفة المرتبطة بالحمض النووي (enChIP) لتحديد البروتينات والأحماض النووية الريبوزية المرتبطة بمناطق جينية معينة. يوفر منهجية مفصلة لعزل التفاعلات الجزيئية المهمة لفهم وظائف الجينوم.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الجينوم
- علم التخلق
- علم الأحياء الجزيئية
الخلفية
- فهم التفاعلات الجزيئية مع المناطق الجينية ضروري لتوضيح الآليات التنظيمية.
- يسمح enChIP بالتحديد المباشر للجزيئات التي تتفاعل مع مناطق جينية معينة.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة في دراسات النسخ والتنظيم فوق الجيني.
- إنها تعزز القدرة على دراسة وظائف جينوم معقدة.
هدف الدراسة
- لعزل مناطق جينية معينة وتحديد الجزيئات التفاعلية.
- لتوفير طريقة موثوقة لدراسة التنظيم النسخي والتنظيم فوق الجيني.
- لعرض تقنية enChIP بشكل فعال.
الطرق المستخدمة
- هندسة الجزيئات المرتبطة بالحمض النووي باستخدام تسلسلات gBlock والفيروسات القهقرية.
- ربط الخلايا وعزلها.
- تفتيت الكروماتين بواسطة الصوت.
- إجراء الترسيب المناعي باستخدام الأجسام المضادة المترافقة.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح للكروماتين من الخلايا المحورة.
- تحديد البروتينات والأحماض النووية الريبوزية المرتبطة بمناطق جينية معينة.
- تظهر تنقية فعالة للمناطق الجينية المستهدفة باستخدام enChIP.
- تقدير العائد من خلال تحليل الكتلة.
الاستنتاجات
- enChIP هي أداة قوية لدراسة التفاعلات الجزيئية في مواقع جينية محددة.
- توفر الطريقة رؤى حول التنظيم النسخي والتنظيم فوق الجيني.
- يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات في أبحاث الجينوم.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
enChIP enables direct, unbiased identification of proteins and RNAs interacting with specific genomic regions, supporting mechanistic de-risking in target validation. This approach enhances predictive confidence by linking genomic loci to functional molecular interactions in transcription and epigenetic regulation. It provides a scalable method for early discovery biology to inform portfolio triage and reduce late-stage biological risk.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying direct molecular interactors of genomic regions of interest.
- Operational Value: Enables functional target validation through unbiased proteomic and transcriptomic profiling.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying pathway context and regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated chromatin inputs for downstream molecular interaction screening.
- Operational Value: Standardizes isolation of specific genomic regions with quantifiable yield (up to 10% purification efficiency).
- Scalability: Supports platform reuse across loci (e.g., promoters, telomeres) using TAL or CRISPR-dCas9 engineering.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-stage genomic findings to disease-relevant mechanisms via associated molecule identification.
- Translational Continuity: Enables biomarker-aligned follow-up through mass spectrometry or RNA sequencing of isolated complexes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical target prioritization by revealing context-specific interactors (e.g., interferon gamma-specific IRF-1 associations).
Pipeline & Workflow Integration
enChIP fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing molecular interaction data that bridges genomic annotation and functional validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating genomic regions while preserving native molecular interactions.
- Screening: Generates assay-ready chromatin fractions for interaction profiling with chemical or genetic perturbations.
- Analytics: Enables quantitative comparison of associated molecules across conditions via mass spec or RNA-seq readouts.
- Translational Research: Connects genomic loci to phenotypic mechanisms through identified proteins and RNAs.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized capability for locus-specific interactome mapping across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in genomic function studies through direct interactor identification.
- Operational Value: Delivers reproducible, standardized isolation of tagged genomic regions using antibody-based immunoprecipitation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating target mechanism early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on molecular context of genomic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning to engineer TAL or gBlock-CRISPR DNA-binding molecules.
- Needs access to sonication equipment, magnetic separation tools, and downstream analytics (mass spec, RNA-seq).
- Demands cross-team standardization for epitope tagging (e.g., FLAG) and antibody conjugation workflows.
- Must account for chromatin accessibility and epitope efficiency across diverse genomic regions and cell types.
- Practical limitation: Efficiency depends on successful tagging and expression of engineered DNA-binding molecules in target cells.
