عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل منطقة جينومية محددة مع الحفاظ على التفاعلات الجزيئية لتحديد الجزيئات التي تتفاعل مع تلك المنطقة الجينومية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على تساؤلات في مجالات الوظائف الجينومية مثل النسخ والتنظيم فوق الجيني. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بالتحديد المباشر للجزيئات التي تتفاعل مع منطقة جينومية محددة.

سيقوم بتوضيح الإجراء Toshitsugu Fujita، وهو أستاذ مساعد من مختبري. وفقًا للبروتوكول المكتوب، قم بتصميم جزيئات ربط DNA المطلوبة. ويتضمن ذلك توليد تسلسل gBlock المطلوب وإدراجه في فيروس قهقري، على سبيل المثال، لإنتاج RNA دليل مرتبط بـ three FLAG-dCas9.

وبدلاً من ذلك، يمكن إنتاج ثلاثة بروتينات FLAG-TAL تتعرف على التسلسل المستهدف. ثم، ووفقاً للبروتوكول المكتوب، يتم إصابة الخلايا بالفيروس القهقري المُحضّر. يتم التأكد من تعبير جزيئات ربط الحمض النووي المهندسة وإنشاء الخط الخلوي.

الآن، ابدأ بعملية الربط التشابكي للخلايا باستخدام الفورمالدهيد. علّق 20 مليون خلية من الخلايا المنقولة جينياً في 30 milliliters من وسط زراعة عادي وأضف 810 microliters من الفورمالدهيد بتركيز 37% للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1%. حضّن الخليط لمدة خمس دقائق عند 37 degrees Celsius. وبعد مرور خمس دقائق، أوقف تفاعل الربط التشابكي بإضافة 3.1 milliliters من الغليسين بتركيز 1.25 molar.

اترك الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل المتابعة. بعد ذلك، قم بطرد مركزي لأنبوب الخلايا عند 300 G لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي مبرد. تخلص من السائل الطافي بعناية واغسل كتلة الخلايا المترسبة في 30 milliliters من PBS عن طريق الخلط والطرد المركزي.

قم بإجراء غسلتين باستخدام PBS. وعند الحاجة، يمكن تخزين الراسب المغسول من الخلايا المثبتة عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. وبالانتقال للخطوة التالية، قم بجمع الكروماتين من الخلايا.

قم بتعليقها في 10 milliliters من منظم التحلل (lysis buffer) واتركها في الحاضنة على الثلج لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، وباستخدام جهاز طرد مركزي مبرد، قم بجمع الخلايا وتخلص من السائل الطافي بعناية. الآن، قم بتعليق كتلة الخلايا المترسبة في منظم تحلل النواة (nuclear lysis buffer) واتركها في الحاضنة على الثلج لمدة 10 دقائق.

قم برج الخليط لفترة وجيزة باستخدام جهاز Vortex كل بضع دقائق أثناء الحضن. ثم قم بجمع الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي. الآن، اغسل الراسب بـ 10 milliliters من PBS وقم بإزالة محلول الغسيل بعملية طرد مركزي أخرى.

ينتج عن ذلك جزء الكروماتين، ويمكن، إذا لزم الأمر، تجميده سريعاً وتخزينه عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. تابع من خلال تعليق كتلة الكروماتين في 800 µL من محلول التحلل المعدل ثلاثة، ثم انقل المعلق إلى أنبوب أصغر سعة 1.5 mL. الآن، قم بتشغيل مسبار الموجات فوق الصوتية عند مستوى الطاقة الثالث بنمط التشغيل المستمر.

لتجزئة الكروماتين، قم بالتبديل يدويًا بين 10 ثوانٍ من السونيكة (الموجات فوق الصوتية) و20 ثانية على الثلج. وفي كل دورة خامسة أو سادسة، قم بتمديد مرحلة التبريد على الثلج إلى دقيقتين لضمان عدم ارتفاع درجة حرارة العينة بشكل مفرط. كرر دورة السونيكة هذه من 10 إلى 18 مرة، مع إبقاء طرف المسبار بعيدًا عن قاع الأنبوب لتجنب تكوّن الرغوة في العينة.

بعد عملية السونكة، اجمع العينة باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد سريع. ثم انقل السائل العلوي الذي يحتوي على الكروماتين المجزأ إلى أنبوب جديد وتخلص من الراسب. راجع البروتوكول المكتوب لمعرفة كيفية تقييم التجزئة.

للتحضير لعملية الترسيب المناعي، قم أولاً بربط الأجسام المضادة بخرز Dynabeads. تم تحديد مقياس عملية الترسيب المناعي هذه لتناسب العينات المستمدة من 20 مليون خلية. أضف حجمًا يعادل 1/5 من منظم تحلل الخلايا المعدل رقم ثلاثة المحتوي على Triton X-100 إلى الكروماتين المجزأ للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1% Triton.

بعد ذلك، أضف الخليط إلى الخرزات المغناطيسية المقترنة بـ IgG الفأر الطبيعي. قم بتحضين التفاعل لمدة ساعة واحدة على جهاز تدوير مع التبريد. لاحقاً، اجذب الخرزات من المحلول لمدة ثلاث دقائق باستخدام حامل مغناطيسي.

بعد ذلك، قم بجمع الراسح. انقل الراسح إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخرزات المغناطيسية المقترنة بالأجسام المضادة anti-FLAG. أجْرِ تفاعل الاقتران هذا طوال الليل على جهاز تدوير عند درجة حرارة 4 °C.

في صباح اليوم التالي، ضع مغناطيساً على الأنبوب لمدة ثلاث دقائق لتجميع الخرزات. بعد ذلك، اسحب السائل الطافي باستخدام الماصة وتخلص منه. الآن، قم بغسل الخرزات.

قم بتعليقها في واحد مليلتر من محلول منظم منخفض الملوحة وحضنها لمدة خمس دقائق على جهاز تدوير عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية. بعد التحضين، قم بعزل الخرزات مغناطيسياً وتخلص من السائل العلوي. كرر خطوة الغسل هذه باستخدام المحلول المنظم منخفض الملوحة مرة أخرى.

باستخدام التقنية ذاتها، قم بإجراء غسلتين إضافيتين باستخدام منظم ملحي عالي التركيز. واصل استخدام هذه الطريقة لغسل الخرزات في منظم كلوريد الليثيوم مرتين. وفي النهاية، اغسل الخرزات باستخدام TBS-IGEPAL CA-630 مرة واحدة فقط.

بعد خطوات الغسل السبع، يتم تعليق الخرزات في 200 µL من محلول استخلاص (elution buffer) وتحضينها عند 37 °C لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، يتم جذب الخرزات باستخدام المغنطة وجمع الراشح في أنبوب جديد. تُكرر خطوة الاستخلاص هذه لزيادة المردود.

بعد ذلك، قم بتنقية حوالي 5% من الـ DNA لتقدير الحصيلة. ابدأ بخلط الجزء الأكبر من السائل المستخلص في تفاعل ترسيب. قم بترسيب الكروماتين طوال الليل عند درجة حرارة 20- درجة مئوية.

في اليوم التالي، قم بطرد العينة مركزياً وتخلص من السائل الطافي. اغسل الراسب باستخدام 1 ml من ethanol بتركيز 70% وكرر عملية الطرد المركزي لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، تخلص من السائل الطافي وعلق الراسب في 40 µL من sample buffer بتركيز 2x.

الآن، قم برج المعلق باستخدام جهاز vortex لمدة خمس دقائق كاملة. ثم، حضّنه عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتمسخ البروتينات وعكس عملية الربط التشابكي. بعد الغليان، قم بتحميل 40 µL من العينة على هلام SDS-PAGE.

عادةً ما يتم استخدام تدرج يتراوح من 4 إلى 20%. يتم تشغيل الهلام حتى تتحرك الصبغة مسافة سنتيمتر واحد أسفل البئر. بعد ذلك، يتم صبغ الهلام وتقطيعه إلى خمس قطع يبلغ طول كل منها حوالي 2 مليمتر.

قم بتخفيف البروتين من قطع الهلام واستخدمه في تحليل مطيافية الكتلة. أما تنقية RNA، المتبوعة بتحليل التسلسل، فقد تم تناولها في البروتوكول المكتوب. وبشكل عام، يمكن تنقية ما يصل إلى 10% من المناطق الجينومية المستهدفة باستخدام تقنية enChIP.

تظهر هنا نتائج التحاليل التي تستهدف منطقة المحفز لجين IRF-1 مقارنة بموضع Sox2 غير المحدد. ومثال آخر هو استهداف التيلوميرات مقابل موضع gamma-satellite غير المحدد. وقد حددت تقنية enChIP SILAC عدة بروتينات مرتبطة بمحفز IRF-1 بطريقة محددة لإنترفيرون غاما.

تم أيضاً تحديد البروتينات المرتبطة بالتيلومير باستخدام تقنية enChIP مدمجة مع مطيافية الكتلة. ثم استُخدم تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA sequencing) بتقنية enChIP لتحديد جزيئات RNA المرتبطة بالتيلوميرات. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات النسخ والتنظيم فوق الجيني لاستكشاف مثل هذه الآليات في أنظمة بيولوجية متنوعة.