مراقبة البصرية من الخلايا الحية النشاط الكهربائي من قبل مترافق البوليمرات

الهدف العام من هذه الطريقة هو التحكم في إمكانات غشاء الخلية عند التحفيز بواسطة نبضات الضوء المرئي. يتم التوسط في عملية النقل الضوئي بواسطة بوليمر مترافق حساس للضوء. توفر هذه الطريقة أداة جديدة في مجال التقنيات لأنها تمثل بديلا قيما للطرق الحالية مثل علم البصريات الوراثي والتحفيز الحراري للتحكم البصري في نشاط الخلايا الحية.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في التكامل الفوري مع أي نوع من الفيزيولوجيا الكهربية ، والدقة الخاصة والزمنية العالية المحتملة ، فهي تقلل من الغزو. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بتجنب نقل الجينات المطلوبة من قبل علم البصريات الوراثي. طريقتنا موصوفة هنا للتحفيز الضوئي لزراعة الخلايا في المختبر.

ولكنه قد يفتح أيضا فرصا مثيرة للاهتمام للتطبيقات في الجسم الحي. سيتم إثبات الإجراء كاترينا بوسيو وسوزانا فاكيرو موراتا إلى ما بعد الدكتوراه من مختبراتنا مع خلفيات الكيمياء البيولوجية والفيزيائية على التوالي. للبدء ، قم بإعداد محلول من البوليمر المترافق الحساس للضوء عن طريق خلط P3HT و PCBM في الكلوروبنزين بتركيز نسبي واحد إلى واحد.

امزج المحلول بمحرك مغناطيسي لمدة أربع ساعات على الأقل عند 60 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتنظيف الشرائح الزجاجية المطلية بأكسيد القصدير الإنديوم مع حمامات متتالية لمدة 10 دقائق من الماء منزوع الأيونات والأسيتون والأيزوبروبانول في مكبر الصوت. جفف زلات الغطاء بمسدس نيتروجين ، ثم عالج الركائز بواسطة منظف البلازما.

بمجرد التنظيف ، ضع الشريحة على ظرف المعطف ، والجانب المطلي ب ITO متجها لأعلى. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من محلول P3HT PCBM إلى الشريحة وقم بتدوير العينة. بعد أن يتم إزالة المعطف ، قم بإزالة العينة ، واستخدم مسحة غرف الأبحاث المغموسة في الأسيتون لتنظيف الجزء الخلفي من الركيزة.

قم بتعقيم الركائز النشطة ضوئيا عن طريق وضعها في حاوية مغطاة مقاومة للحرارة وتسخينها على حرارة 120 درجة مئوية لمدة ساعتين. ثم انقل العينات إلى غطاء معقم واتركها تبرد. من هذه النقطة فصاعدا ، حافظ على عقم

ضع الركائز النشطة ضوئيا في صفيحة من ستة آبار. نظرا لكراهية الماء لطبقة البوليمر المترافقة ، اصنع بئر بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان لإصلاح العينة ، وحصر المحاليل كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. بعد ذلك ، ضع الركائز النشطة ضوئيا في آبار اللوحة ، وقم بتغطية سطح كل عينة بالكامل ب 500 إلى 750 ميكرولتر من محلول ملليغرام لكل لتر من الفبرونيكتين في PBS.

احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد الحضانة ، استخدم ماصة زجاجية لإزالة محلول الفيبرونيكتين ، ثم اغسل الركائز مرة واحدة باستخدام ملليلترين من PBS. أولا ، أضف حجما إجماليا من 750 إلى 1 ، 000 ميكرولتر من وسط النمو الكامل لكل بئر.

بعد ذلك ، لوحة 15 ، 000 AGK293 خلية لكل سنتيمتر مربع من الركيزة النشطة ضوئيا في كل بئر. ثم احتضان الخلايا لمدة 24 إلى 48 ساعة. يمكن زراعة الخلايا بسهولة على الركائز النشطة ضوئيا ، بشرط ترسيب طبقة التصاق مناسبة ، مثل الفيبرونكتين.

للبدء ، قم بإعداد كل من المحاليل خارج الخلية وداخل الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. عقم المحاليل عن طريق تمريرها عبر مرشح 0.2 ميكرون. بعد ذلك ، قم بتسخين المحلول خارج الخلية مسبقا عن طريق وضعه في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.

أيضا ، املأ حقنة سعة مليلتر واحد بالمحلول داخل الخلايا وقم بتجهيزها بإبرة قياس 34. حافظ على المحلول داخل الخلايا على اتصال بالثلج لتجنب تدهور ATP. بعد ذلك ، خذ ركيزة مغلفة بالخلايا من الحاضنة وقم بإزالة PDMS جيدا بعناية.

ثم قم بإزالة وسط النمو بماصة زجاجية واشطف العينة ببطء بمحلول خارج الخلية لتجنب انفصال الخلايا. أضف ثلاثة ملليلتر من المحلول خارج الخلية إلى كل بئر ثم انقل اللوحة إلى حامل العينة لمحطة الفيزيولوجيا الكهربية. بمجرد وضعه في مكانه ، اضبط القطب المرجعي في البئر المراد اختباره.

بعد ذلك ، قم بإعداد ماصة زجاجية دقيقة جديدة لمشبك التصحيح باستخدام مجتذب ماصة دقيقة. املأ نصف الماصة بمحلول داخل الخلايا. استخدم المعالج الدقيق لوضع ماصة التصحيح على مقربة من غشاء الخلية المحدد.

أثناء وضع الموضع، اضغط بالضغط الزائد على الماصة لتجنب التصاق الأوساخ بالحافة. مع وجود الماصة على ارتفاع بضعة ميكرونات فوق الخلية ، ابدأ في خفض الماصة باتجاه غشاء الخلية مع تثبيت مقاومة الماصة على برنامج التحكم في التصحيح. عندما تزداد مقاومة الماصة حوالي ميغا أوم واحد ، قم بإزالة الضغط الزائد وقم بتطبيق شفط لطيف لتشكيل الجيجاسيل بين الماصة وغشاء الخلية.

بعد ذلك، قم بتطبيق جهد سالب سالب 40 مللي فولت على الماصة للمساعدة في تثبيت مانع التستم. عوض عن الزوال السعوي بسبب سعة الماصة باستخدام الأوامر النسبية الموجودة على مضخم التصحيح و/أو برنامج التحكم في التصحيح. ضع نبضة شفط قصيرة ومكثفة على الماصة لكسر الغشاء والسماح بالوصول الكهربائي إلى سيتوبلازم الخلية.

بعد ذلك ، اضبط مضخم التصحيح على وضع المشبك الحالي بحيث لا يتم حقن أي تيار في الخلية. في وضع المشبك الحالي ، تتبع إمكانات غشاء الخلية وانتظر بضع دقائق حتى يستقر. بمجرد الاستقرار ، قم بتطبيق بروتوكول الإضاءة المطلوب على الخلية عن طريق إضاءة الغشاء النشط ضوئيا أسفل الخلية بضوء يتراوح من 450 إلى 600 نانومتر.

سجل تأثير الضوء على إمكانات الغشاء. تؤدي نبضات الضوء القصيرة التي تتراوح من 10 إلى 20 مللي ثانية إلى إزالة الاستقطاب العابر للخلية ، بينما مع استمرار الإضاءة الطويلة في حدود مئات المللي ثانية ، يتم ملاحظة المبالغة حتى يتم إطفاء الضوء. يمكن أن يؤدي التحفيز البصري للخلايا بوساطة الركائز النشطة ضوئيا إلى تأثيرات مختلفة على غشاء الخلية ، اعتمادا على مدة المنبه الضوئي.

يتبع الارتفاع السريع ، مثل الارتفاع الموضح هنا ، إزالة استقطاب عابر في حدود عشرات المللي ثانية. بالنسبة لنبضات الضوء القصيرة عند إطفاء الضوء ، لوحظ سلوك معاكس. تعزى هذه الإشارات إلى تباين في سعة الغشاء بسبب التسخين الموضعي بعد امتصاص الضوء.

للإضاءة لفترات طويلة ، يتحول إزالة الاستقطاب الأولي إلى فرط استقطاب الخلية. هذه الظاهرة لها أصل حراري مرة أخرى ، ولكن في هذه الحالة ، ترتبط باختلاف إمكانات توازن الغشاء بسبب التغير في الموصليات للقناة الأيونية الناجمة عن زيادة درجة الحرارة. من المهم ملاحظة أن هذه التقنية مرنة للغاية ويمكن تكييفها مع الاحتياجات الخاصة لتجربة معينة ، على سبيل المثال ، عن طريق تغيير البوليمر السام أو عملية التصنيع أو بروتوكول الإضاءة.

ومع ذلك ، قبل تغيير البروتوكول ، يجب على المرء أولا التحقق من الخصائص المهمة للبوليمر النشط مثل توافقه الحيوي ، وملاءمته لعملية التعقيم ، والاستقرار الكهروكيميائي والزمني. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحقيق واجهة هجينة بين البوليمرات الضامة والخلايا الحية وكيفية استخدامها للتحكم البصري في نشاط الخلية. نعتقد أن هذه التقنية تعد أيضا بأن تصبح أداة تكميلية في علم الأعصاب للتحقيقات في المختبر وأيضا لفتح منظور جديد في تطبيقات الجسم الحي.

ومع ذلك ، لتحسين البروتوكول ، فإن بذل جهد قوي ومشترك من علماء المواد وعلماء الأعصاب والفيزيائيين والأطباء إلزامي.