Name: مراقبة البصرية من الخلايا الحية النشاط الكهربائي من قبل مترافق البوليمرات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: اكتشف طريقة تحفيز النشاط الكهربائي للخلايا باستخدام البوليمرات العضوية شبه الموصلة والضوء المرئي. توفر هذه التقنية بديلاً غير جراحي للتحكم في جهد غشاء الخلايا بدون الحاجة لنقل الجينات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم دعم العمل من قبل الاتحاد الأوروبي من خلال مشروع FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA ، 
Telethon - إيطاليا (منح GGP12033 و GGP14022) ، Fondazione Cariplo (معرف المنحة 2013-0738).

1. إعداد متفاعل ركائز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد P3HT: PCBM الحل (1: 1 ث / ث) في الكلوروبنزن بتركيز P3HT من 20 جرام / لتر. مزيج الحل مع محرك مغناطيسي لمدة 4 على الأقل ساعة على 60 درجة مئوية. النظر في حجم 150 ميكرولتر من محلول لكل الركيزة لتكون مستعدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظيفة الشرائح الزجاجية المغلفة ايتو (R ق = 10 Ω / متر مربع، 18x18 مم 2، سمك 170 ميكرون) مع حمامات متتالية من الماء منزوع الأيونات، والأسيتون والأيزوبروبانول في sonicator (10 دقيقة لكل خطوة). تجفيف coverslips بمسدس النيتروجين. وضع العينات في نظافة البلازما في 100 واط لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيداع طبقة رقيقة من الطبقة النشطة على ركائز تنظيفها عن طريق تدور طلاء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع طرف الماس، وقطع شريحة زجاجية المجهر، (سمك ≈ 1 مم) لنفس الأبعاد الجانبية للركائز ITO المغلفة. إزالة P3HT: حل PCBM من موقد واتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين سانت اثنينEPS البرنامج تدور المغطي: ط) 30 ثانية في 800 دورة في الدقيقة. ب) 30 ثانية في 1600 دورة في الدقيقة. وضع الشريحة على تشاك لتدور المغطي والبدء في الفراغ لإصلاحه. وضعت قطرة من الأسيتون على الشريحة ثم الركيزة تنظيفها، مع الجانب ITO المغلفة متجهة لأعلى. بدء دوران تدور المغطي للتخلص من الأسيتون الزائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 150 ميكرولتر من P3HT: حل PCBM على ركائز والبدء من جديد لتدور المغطي (استخدام نفس البروتوكول هو موضح في 1.3.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد انتهاء تدور المغطي، وإزالة عينة وفصل بعناية الركيزة المغلفة من شريحة زجاجية. تنظيف الجزء الخلفي من الركيزة مع مسحة غرف الأبحاث مغموسة في الأسيتون. ملاحظة: يمكن تخزين ركائز متفاعل لبضعة أيام في مربع الظلام حتى استخدامها. لفترات أطول، والاحتفاظ بها في صندوق قفازات مع غاز خامل. </li></ol></li></ol> 2. إعداد خلية ثقافة متوسطة والكهربية حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة النمو الكامل (CGM) لHEK-293 الخلايا: Dulbecco التعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) لا الحرارة المعطل، 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. تعقيم المتوسطة مع نظام 0.2 ميكرون الترشيح وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل خارج الخلية في الماء عالى النقاء (تركيزات مم): 135 كلوريد الصوديوم، 5.4 بوكل، 5 HEPES، 10 الجلوكوز، 1.8 CaCl 2، 1 MgCl 2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم. تعقيم الحل مع نظام 0.2 ميكرون الترشيح وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل داخل الخلايا في الماء عالى النقاء (تركيزات مم): 12 بوكل، 125 K-غلوكونات، 1 MgCl 2، 0.1 CaCl 2، 10 EGTA، 10 HEPES، 10 ATP-نا 2. لاحظ أن ATP-نا 2 حساسة للحرارة وإضافته آخر. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم. تعقيم الحل مع نظام 0.2 ميكرون الترشيح، وقسامة في 1 مل الأنابيب وتخزينها في -20 ° C. </li></ol> 3. طلاء HEK-293 الخلاياعلى ركائز النشطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الركيزة متفاعل في كوب زجاجي مغطاة الألومنيوم أو طبق بتري مغلقة ووضعها في الفرن على 120 درجة مئوية لمدة 2 ساعة للتعقيم. من هذه اللحظة فصاعدا، تنفيذ جميع العمليات في ظروف معقمة. وضع العينات في غطاء العقيمة والسماح لهم يبرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف الركيزة متفاعل مع طبقة التصاق للحد من للا مائية السطحية وتعزيز التصاق الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ركائز النشطة في طبق بتري P35 أو لوحة 6 multiwell. ونظرا لللا مائية طبقة البوليمر مترافق، وجعل polydimethylsiloxane (PDMS) جيد لإصلاح العينة وحصر الحلول. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج PDMS ومحفز في 10: نسبة 1 بقضيب الزجاج للحصول على الطين اللزج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الطين في لوحة 6 multiwell، الاستغناء مبلغ يكفي لتغطية نصف كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر PDMS البلمرة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع PDMS الشفاء في منتصف لobtaining شكل مربع من نفس البعد من العينة البوليمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الآبار PDMS عن طريق الغمر في 70٪ خليط الماء الإيثانول لمدة 30 دقيقة على الأقل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة استخدام PDMS جيدا، خدش طبقة متفاعل على طول الحدود من البئر مع ملاقط مدببة، من أجل تجنب انفصال طبقة بأكملها عند إزالة PDMS جيدا بعد زراعة الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية كامل سطح كل عينة مع الحل فبرونيكتين (2 ملغم / لتر في PBS). وحدة تخزين بين 500-750 ميكرولتر لكل عينة وعادة ما يكفي إذا كان PDMS كذلك يستخدم (السطحية واضح من البئر: 15x15 مم 2). دون PDMS جيدا، حوالي 2 مل من محلول فبرونيكتين ضرورية لتزج تماما العينة. الانتباه إلى أن الركيزة لا تطفو في حين اضاف الحل. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل فبرونيكتين مع ماصة الزجاج ويغسل مرة واحدة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ررأكل HEK-293 الخلايا على العينات المعالجة فبرونيكتين في كثافة 15000 خلية / سم 2 في كامل متوسطة النمو. استخدام حجم 750-1،000 ميكرولتر من CGM لكل عينة إذا كان PDMS كذلك يستخدم، وإلا 2-3 مل من CGM اللازمة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24-48 ساعة. </li></ol> 4. بروتوكول تحفيز الضوئية والكهربية القياسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حل خارج الخلية في حمام مائي عند 37 ° C إلى thermalize. ذوبان الجليد الحل داخل الخلايا، ووضعها في حقنة 1 مل مع إبرة قياس 34 والاحتفاظ بها في اتصال مع الثلج لتجنب تدهور ATP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ الركيزة المغلفة خلية من الحاضنة، وإزالة بعناية PDMS جيدا إذا كان موجودا. إزالة المتوسطة النمو مع ماصة الزجاج وشطف العينة مع حل خارج الخلية. المضي قدما ببطء لتجنب انفصال الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجهاز في صاحب العينة للمحطة الكهربية مع solutio خارج الخليةن والقطب المرجعية. إعداد بال micropipettes الزجاج جديدة لالتصحيح، المشبك مع مجتذب (مقاومة مثالية في نطاق 2-4 MΩ). ملء نصف ماصة مع الحل داخل الخلايا وتركيبها على micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بحث عن الخلية الصحيحة لرأب الصدع على الجهاز. لتجنب الإثارة غير المرغوب فيها من الركيزة متفاعل، واستخدام الإضاءة الأشعة تحت الحمراء للتصوير، وضع مرشح تمرير الطول الموجي الطويل (على سبيل المثال، خفض الطول الموجي λ = 750 نانومتر يمكن استخدامها للبوليمرات امتصاص في الظاهر) أمام للإضاءة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصحيح الخلية المحددة وتطبيق البروتوكول المطلوب لتحفيز البصري من خلال توفير الضوء على عينة عبر مسار مضان الإثارة المجهر (الشكل 1). وصف مفصل للبروتوكول التصحيح، المشبك يمكن العثور في اشارة 20. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع ماصة التصحيح على مقربة من غشاء الخلية مع مناور المصغر. خلال تحديد المواقع، تطبيق overpressurه إلى ماصة من أجل تجنب التصاق الأوساخ على معلومات سرية. يجب أن تكون ماصة بضعة ميكرونات فوق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تخفيض ماصة نحو غشاء الخلية في حين تسيطر على المقاومة ماصة على برنامج حاسوبي لمراقبة التصحيح. عندما المقاومة ماصة زاد حوالي 1 MΩ، وإزالة الزائد من ماصة أثناء تطبيق طيف الامتصاص، من أجل تشكيل gigaseal بين ماصة وغشاء الخلية (أي ينبغي أن تزيد المقاومة تقاس بقيمتها أكبر من 1 GΩ) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق السلبية المحتملة لماصة على مقربة من خلية المتوقعة المحتملة يستريح (لHEK293 الخلية لإمكانات -40 بالسيارات يمكن استخدامها) للمساعدة في استقرار الختم. تعويض العابرين بالسعة بسبب السعة ماصة مع الأوامر النسبية على مكبر للصوت التصحيح و / أو برنامج حاسوبي لمراقبة التصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كسر الغشاء للسماح بالوصول الكهربائية إلى السيتوبلازم الخلية عن طريق تطبيق شفط نبضة قصيرة ومكثفةلماصة. تعيين مكبر للصوت التصحيح لوضع المشبك الحالي (I = 0، أي مع عدم وجود حقنها في الخلايا الحالية) لتعقب إمكانات غشاء الخلية. انتظر بضع دقائق لمعرفة ما إذا كان احتمال خلية مستقرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق بروتوكول الإضاءة المطلوبة إلى الخلية وتسجيل تأثير على غشاء المحتملة. ملاحظة: يمكن أن يتم تسليم الإضاءة على عينة إما من أسفل أو من أعلى، اعتمادا على بنية المجهر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الطول الموجي الإثارة أن يمتص جيدا من المواد الفعالة؛ لP3HT: PCBM مزيج، الطول الموجي في نطاق 450-600 نانومتر يمكن استخدامها. الكثافة photoexcitation مناسبة هي في حدود 10-100 ميغاواط / مم 2. ملاحظة: نبضات قصيرة من الضوء (أقل من 10-20 مللي ثانية) النتيجة في الاستقطاب عابرة للخلية، بينما مع الإضاءة لفترات طويلة (مئات ميلي ثانية أو نبضات أطول) لوحظ فرط الاستقطاب المستمر إلى أن يتم تشغيل ضوء قبالة. </li></ol></li&gt; </ol></li></ol>

<ol><li>Alivisatos, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotools+for+Neuroscience+and+Brain+Activity+Mapping%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping.</a> ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).</li>
<li>Spira, M. E., Hai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-electrode+array+technologies+for+neuroscience+and+cardiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology.</a> Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).</li>
<li>Scanziani, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).</li>
<li>Bareket-Keren, L., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+interfaces+for+light+directed+neuronal+stimulation%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Nanomed%22%5BJournal%5D)">Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges.</a> Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).</li>
<li>Antognazza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+Light+on+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Shedding Light on Living Cells.</a> Adv. Mater. , (2014).</li>
<li>Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+semiconductors+for+artificial+vision%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Organic semiconductors for artificial vision.</a> J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).</li>
<li>Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic-based+tristimuli+colorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Organic-based tristimuli colorimeter.</a> Appl. Phys. Lett. 90 (16), 163509(2007).</li>
<li>Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexible+Organic+Electronics+in+Biology%3A+Materials+and+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices.</a> Adv. Mater. , (2014).</li>
<li>Khodagholy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuroGrid%3A+recording+action+potentials+from+the+surface+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain.</a> Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).</li>
<li>Campana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocardiographic+Recording+with+Conformable+Organic+Electrochemical+Transistor+Fabricated+on+Resorbable+Bioscaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold.</a> Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).</li>
<li>Bonetti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Lysinated+Thiophene-Based+Semiconductor+as+a+Multifunctional+Neural+Bioorganic+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22+Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface.</a> Adv. Healthc. Mater. , (2015).</li>
<li>Benfenati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+organic+transistor+structure+for+bidirectional+stimulation+and+recording+of+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons.</a> Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).</li>
<li>Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rise+of+Organic+Bioelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">The Rise of Organic Bioelectronics.</a> Chem. Mater. 26 (1), 679-685 (2014).</li>
<li>Pires, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+differentiation+by+electrical+stimulation+using+a+cross-linked+PEDOT+substrate%3A+Expanding+the+use+of+biocompatible+conjugated+conductive+polymers+for+neural+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Gen.+Subjects%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering.</a> BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).</li>
<li>Ghezzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+bioorganic+interface+for+neuronal+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation.</a> Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).</li>
<li>Ghezzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymer+optoelectronic+interface+restores+light+sensitivity+in+blind+rat+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photonics%22%5BJournal%5D)">A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas.</a> Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).</li>
<li>Benfenati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photostimulation+of+Whole-Cell+Conductance+in+Primary+Rat+Neocortical+Astrocytes+Mediated+by+Organic+Semiconducting+Thin+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films.</a> Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).</li>
<li>Martino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+cellular+stimulation+in+functional+bio-polymer+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces.</a> Sci. Rep. 5 (8911), (2015).</li>
<li>Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+solid-liquid+polymer+photodiode+for+the+bioenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment.</a> Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501(2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essentials+of+Neuroscience.+Patch+Clamp+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).</li>
<li>Scarpa, G., Idzko, A. L., Götz, S., Thalhammer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+Studies+of+Functionalized+Regioregular+Poly%283-hexylthiophene%29+Layers+for+Sensing+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications.</a> Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).</li>
<li>Bellani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+P3HT%2FOxygen+Charge+Transfer+Complex+Identification+in+Thin+Films+Exposed+to+Direct+Contact+with+Water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water.</a> J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).</li>
<li>Wells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+stimulation+of+neural+tissue+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical stimulation of neural tissue in vivo.</a> Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).</li>
<li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).</li>
<li>Duke, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+selective+suppression+of+neural+activity+with+infrared+light%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Transient and selective suppression of neural activity with infrared light.</a> Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

خطوات حاسمة من البروتوكول ذكرت لتحفيز البصري للخلايا تتعلق بشكل رئيسي في المختبر اختيار البوليمر حساسة للضوء، والمعلمات التعقيم الحراري، وشدة ومدة المنبهات الخفيفة. تم اختيار الفيلم PCBM رقيقة هنا، لأنه يضمن الاستقرار الزماني والكهروكيميائية جيدة: A P3HT. ومع ذلك، ينبغي للمرء أن تلاحظ أن ليس كل البوليمرات الحساسة للضوء يمكن أن تقدم عروضا التماثلية، 22 بشكل أكثر تحديدا على الإضاءة. بالإضافة إلى ذلك، في هذه الحالة اختيار التعقيم الحراري المعلمات لا تؤدي ...

إمكانية للتلاعب في النشاط الخلوي مع القرار المكانية والزمانية الدقيق تمثل استراتيجية رئيسية في البحث العلمي العصبي وعلاج الاضطرابات العصبية والنفسية. وتستند 1 الأساليب التقليدية على التحفيز الكهربائي للخلايا باستخدام أقطاب المتمركزة في القرب أو في اتصال مع النظام المستهدف، (2) الذي يمكن أن يكون من تعقيد مختلفة (وحيدة الخلية، الشبكة الخلوية، شرائح الدماغ، في الجسم الحي أنسجة المخ). خلال القرن الماضي، وقد وفرت استخدام التصحيح، المشبك، والمعادن وأقطاب متكاملة الركيزة صورة مفصلة عن علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية من الخلايا العصبية واحدة وآليات عمل الشبكات العصبية. ومع ذلك، التحفيز الكهربائي يعاني من القيود الهامة. يرتبط أول من القرار المكانية الفقراء عموما بسبب الأبعاد المادية من الأقطاب الكهربائية والهندسة بهم ثابتة، والتي لا يمكن تكييفه بسهولةنظم نظم معقدة مثل الأنسجة البيولوجية. أيضا، المشاكل المتصلة مقاومة الأقطاب وعبر الحديث بين نظم التحفيز وتسجيل قد تتدهور نسبة النهائية للقياسات إشارة إلى الضوضاء. 3 ومن ناحية أخرى، فإن استخدام الضوء لتحفيز يمكن أن يساعد على التغلب على الكثير من القيود من نهج الكهربائية. أولا وقبل كل شيء، فإنه يوفر المكاني لم يسبق لها مثيل (&lt;1 ميكرون)، والقرار الزماني (&lt;1 ميللي ثانية)، مما يجعل من الممكن لاستهداف أنواع معينة من الخلايا أو حتى حجرات خلية فرعية. وبالإضافة إلى ذلك فمن غاية غير الغازية لأنه يتجنب أي اتصال جسدي مع الأنسجة من الاهتمام والتحفيز disentangles من التسجيل. وعلاوة على ذلك، سواء شدة الضوء والطول الموجي يمكن أن تنظم بدقة وبروتوكولات التحفيز بالتالي المتنوعة يمكن تطبيقها. 3،4 ومع ذلك، فإن الغالبية العظمى من الخلايا الحيوانية لا تقدم أي حساسية معينة للضوء. عدة استراتيجيات لstimulatio البصريةن وبالتالي تم اقتراح، إما استغلال الوسطاء الجزيئية الحساسة للضوء في مكان قريب أو داخل الخلايا، أو باستخدام جهاز متفاعل وضعها خارجيا، على مقربة من الخلية. تشير الفئة الأولى إلى الآليات الذاتية مثل التحفيز عن طريق مرئية أو الأشعة تحت الحمراء (IR) الضوء، فضلا عن استخدام أي مركبات photoisomerizable / photocleavable أو التعبير الجيني للالمحركات الجزيئية للضوء (optogenetics). وتشمل الفئة الأخيرة التقنيات لتحفيز خارجي يتحقق مع استخدام غير العضوية نانو / الجسيمات الدقيقة أو ركائز السيليكون ضوئية. 5 ومع ذلك، كل هذه النظم والجوانب المشرقة وعيوب. على وجه الخصوص، وامتصاص الذاتية للخلايا في المدى المنظور ضعيفة ولا يمكن الاعتماد عليها، والجيل يصاحب ذلك من أنواع الاكسجين التفاعلية قد تكون ضارة إلى الخلية. بشكل عام، يتم استخدام الأشعة تحت الحمراء لإحداث التسخين الحراري المحلية بسبب امتصاص الماء، ولكن معامل انقراض المياه الصغيرة، مما يتطلب الحاديرونغ ضوء الأشعة تحت الحمراء (من عشرات إلى مئات W / مم 2) يصعب تسليم عبر البصريات المجهر القياسية ويمكن أن تشكل مخاوف تتعلق بالسلامة للتطبيقات في الجسم الحي. من ناحية أخرى، مركبات حبس-صور للتحويل لديها إجراءات محدودة الوقت، وغالبا ما تتطلب ضوء الأشعة فوق البنفسجية التي يصعب تسليم نظرا لاختراق الأنسجة محدودة. إضافة إلى أنها تعاني من مشاكل انتشار المركبات تفعيلها على التحلل الضوئي خارج المنطقة المضاءة. وأخيرا، قد سمحت أدوات optogenetic العلماء لاستهداف الفئات السكانية الخلوية محددة ومحصورة الفرعية والناشئة بسرعة باعتبارها واحدة من التكنولوجيات الرئيسية في البحث العلمي العصبي. ومع ذلك، وإدراج شريحة الحمض النووي الخارجية عبر ناقلات فيروسية يثير قضايا هامة تتعلق بالسلامة، لا سيما في ضوء اعتماد على المرضى من البشر. 5،6 لهذه الأسباب، والبحث عن المواد والأجهزة الجديدة قادرة على خلية التلاعب البصري هو موضوع ساخن للغاية. في الآونة الأخيرة، رواية، وقد اقترح النهج القائم على استخدام البوليمرات مترافق حساسة للضوء، وقادرة على تنبيغ حافزا البصرية بكفاءة في التشكيل من النشاط الكهربائي الخلية. وتحفيز الخلية التي كتبها بوليمر Photoexcitation (CSPP) تقنية تستغل العديد من الميزات تمكين مفتاح نموذجية من أشباه الموصلات العضوية: فهي حساسة في جوهرها إلى النور في المدى المرئي (7)؛ فهي حيويا، لينة ومطابق ومرونتها الميكانيكية يسمح واجهة الحميمة مع النسيج على حد سواء في المختبر والمجراة 10/08. بغض النظر عن ذلك، فإنها يمكن أن functionalized بسهولة إلى التكيف بشكل أفضل مع واجهة مع الخلايا الحية، وتمكين الإثارة محددة، تحقق والاستشعار القدرات. 11،12 وعلاوة على ذلك، فإنها تدعم الإلكترونية وكذلك النقل الأيونية، مما يجعلها مثالية لمزيج البيولوجيا الإعلانية الإلكترونية. 13،14 ومن المثير للاهتمام، وأنها يمكن أن تعمل في وضع الضوئية، وتجنب الحاجة إلى تطبيق التحيز و الخارجية15 أو التحفيز البصري خلية فعالة. وقد موثوقية تقنية CSPP سابقا تظاهروا في العديد من النظم، بما في ذلك الخلايا العصبية الأولية، 15،16 النجمية، 17 خطوط الخلايا الثانوية 18 والأنسجة الشبكية explanted. 16 في هذا العمل، وجميع الخطوات اللازمة لافتعال حساسة للضوء والحيوية والبوليمر ووصف واجهة 19 لتحفيز البصري نظم في المختبر بالتفصيل. كحالة دراسة، والعضوية مزيج الضوئية نموذج أولي من الإقليم العادية بولي (3-hexylthiophene) (ص ص-P3HT)، يعمل بوصفه المانحة الإلكترون، واستر فينيل-C61-زبدي، حمض الميثيل (PCBM)، بوصفها ويعمل متقبل الإلكترون. كما النظام البيولوجي، وتستخدم الجنينية البشرية الكلى (HEK-293) الخلايا. وأعطى مثالا على بروتوكول ضوئي مع تسجيل النسبي للنشاط الخلايا عن طريق القياسات الكهربية. منصة وصفغير أنه من صحة العامة، وأنها يمكن أن تمتد بسهولة إلى استخدام البوليمرات مترافق أخرى (عن طريق ضبط عملية الحل إعداد والمعلمات ترسب بشكل صحيح)، وأنواع مختلفة من الخلايا (عن طريق تغيير بشكل صحيح بروتوكول زراعة الخلايا، والطلاء الداخلي والوقت المطلوب لبذر الخلايا وانتشار) والبروتوكولات التحفيز المختلفة (ضوء الطول الموجي والتردد محفزات ومدة وكثافة photoexcitation).

<table><tbody><tr><td>rr-P3HT</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>698989-5G</td><td></td></tr><tr><td>ركائز مطلية ب ITO</td><td>Nano-CS</td><td>IT10300100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>كلوروبنزين</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>319996</td><td></td></tr><tr><td>PCBM</td><td>Nano-C</td><td>Nano-CPCBM-BF</td><td></td></tr><tr><td>acetone &nbsp ؛</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>270725</td><td></td></tr><tr><td>كحول الأيزوبروبيل</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>خلايا HEK</td><td>معايير LGC srl</td><td>ATCC-CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>E-MEM</td><td>LGC معايير srl</td><td>ATCC-30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma معايير Aldrich</td><td>E8008-FBS</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>LGC srl</td><td>ATCC-30-2020</td><td></td></tr></tbody></table>

مراقبة البصرية من الخلايا الحية النشاط الكهربائي من قبل مترافق البوليمرات

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

تمثل الواجهات الهجينة أداة جديدة للتطبيقات المختبرية وفي الجسم الحي. على وجه الخصوص ، تعرض البوليمرات المترافقة العديد من الخصائص المثلى كركائز للأنظمة البيولوجية ، مثل التوافق الحيوي الجيد ، والخصائص الميكانيكية الممتازة ، وتكنولوجيا المعالجة الرخيصة والسهلة ، وإمكانية الترسيب على ركائز خفيفة ورقيقة ومرنة. تم استخدام هذه المواد للواجهات الخلوية مثل المجسات العصبية والترانزستورات للإثارة وتسجيل النشاط العصبي وأجهزة الاستشعار الحيوية والمشغلات لإطلاق الأدوية. أظهرت التجارب الحديثة أيضا إمكانية استخدام البوليمرات المترافقة للتعديل البصري بالكامل للنشاط الكهربائي للخلايا. تم الإبلاغ عن العديد من حالات الدراسة في المختبر ، بما في ذلك الشبكات العصبية الأولية والخلايا النجمية وخلايا الخط الثانوية. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن نقل صور الإشارة بوساطة البوليمرات العضوية يعيد حساسية الضوء في شبكية العين المتدهورة ، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام هذه الأجهزة للطرف الاصطناعي للشبكية الاصطناعية في المستقبل. بشكل عام ، تمثل البوليمرات المترافقة الحساسة للضوء نهجا جديدا للتعديل البصري للنشاط الخلوي.
 في هذا العمل ، يتم وصف جميع الخطوات المطلوبة لتصنيع واجهة بوليمر حيوي للإثارة البصرية للخلايا الحية. تتمثل وظيفة الواجهة النشطة في تحويل المنبه الضوئي إلى تعديل لإمكانات غشاء الخلية. كحالة دراسية ، مفيدة للدراسات المختبرية ، يتم استخدام غشاء رقيق من البولي ثيوفين كطبقة وظيفية ممتصة للضوء ، ويتم استخدام خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK-293) كمكون بيولوجي للواجهة. يتم توفير أمثلة عملية للتحكم الناجح في إمكانات غشاء الخلية عند التحفيز بنبضات ضوئية مختلفة المدة. على وجه الخصوص ، يتضح أنه يمكن تحقيق تأثيرات إزالة الاستقطاب وفرط الاستقطاب على غشاء الخلية اعتمادا على مدة حافز الضوء. البروتوكول المبلغ عنه ذو صلاحية عامة ويمكن تمديده مباشرة ليشمل مستحضرات بيولوجية أخرى.

الخلايا يمكن أن يكون مثقف بسهولة على P3HT: ركائز PCBM، شريطة أن يكون طبقة التصاق مناسبة وتودع (مثل فبرونيكتين المستخدمة في الخطوة 3.2 من بروتوكول صفها). P3HT: PCBM قمم امتصاص البصرية في الجزء الأخضر من الطيف المرئي. ومع غيرها من البوليمرات مترافق الحساسة للضوء يمكن اختيار، وفقا لمجموعة موجات ضوئي المفضل (الشكل 2). وقد تجلى توافق مع الحياة من هذه ركائز ليس فقط مع خطوط الخلايا 18،21 مثل HEK-293، ولكن أيضا مع الثقافات الأول...

تم وصف طريقة لتحفيز النشاط الكهربائي لمزارع الخلايا في المختبر بالضوء المرئي ، بناء على استخدام البوليمرات العضوية شبه الموصلة.

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

الهدف العام من هذه الطريقة هو التحكم في جهد الغشاء الخلوي عند التحفيز بنبضات من الضوء المرئي. وتتم عملية تحويل الطاقة الضوئية بواسطة بوليمر مترافق حساس للضوء. وتوفر هذه الطريقة أداة جديدة في المجال التقني، حيث تمثل بديلاً قيماً للطرق الحالية مثل علم البصريات الوراثي (optogenetics) والتحفيز الحراري للتحكم البصري في نشاط الخلايا الحية.تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في قابليتها السريعة للتكامل مع أي نوع من أنواع الفيزيولوجيا الكهربائية، والدقة المكانية والزمانية العالية المحتملة، كما أنها تقلل من التدخل الجراحي. علاوة على ذلك، فهي تتيح تجنب عملية نقل الجينات التي تتطلبها علم البصريات الوراثي (optogenetics). ونصف هنا طريقتنا للتحفيز الضوئي للمزارع الخلوية في المختبر (in vitro).ولكن قد يفتح ذلك أيضاً فرصاً مثيرة للتطبيق في المختبر (in vivo). ستقوم كل من كاتينا بوسيو وسوسانا فاكيرو موراتا، وهما باحثتان في مرحلة ما بعد الدكتوراه من مختبراتنا بخلفيات في الكيمياء الحيوية والكيمياء الفيزيائية على التوالي، بشرح هذا الإجراء. للبدء، قم بتحضير محلول من البوليمر المترافق الحساس للضوء عن طريق خلط P3HT و PCBM في الكلوروبنزين بتركيز نسبي واحد إلى واحد.امزج المحلول باستخدام محرك مغناطيسي لمدة أربع ساعات على الأقل عند 60 °C. بعد ذلك، نظف الشرائح الزجاجية المطلية بأكسيد القصدير والإنديوم عن طريق غمرها بالتتابع لمدة 10 دقائق في حمامات من الماء منزوع الأيونات، والأسيتون، والأيزوبروبانول باستخدام جهاز التنظيف بالموجات فوق الصوتية. جفف شرائح التغطية باستخدام مسدس نيتروجين، ثم عالج الركائز باستخدام منظف البلازما.بمجرد التنظيف، ضع الشريحة على محور جهاز الطلاء الدوراني (spincoater)، بحيث يكون الجانب المطلى بـ ITO متجهًا للأعلى. بعد ذلك، أضف 150 µL من محلول P3HT PCBM إلى الشريحة وقم بطلاء العينة دورانيًا. بعد انتهاء جهاز الطلاء الدوراني، أخرج العينة، واستخدم مسحة غرفة نظيفة مغموسة في الأسيتون لتنظيف الجزء الخلفي من الركيزة.قم بتعقيم الركائز النشطة ضوئياً عن طريق وضعها في حاوية مغطاة ومقاومة للحرارة وتسخينها عند 120 درجة مئوية لمدة ساعتين. بعد ذلك، انقل العينات إلى غطاء معقم واتركها لتبرد. ومن هذه النقطة فصاعداً، حافظ على تعقيم العينات.ضع الركائز النشطة ضوئياً في طبق يحتوي على ستة آبار. ونظراً للطبيعة الكارهة للماء لطبقة البوليمر المترافق، قم بإنشاء بئر من مادة polydimethylsiloxane لتثبيت العينة، وحصر المحاليل كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق. بعد ذلك، ضع الركائز النشطة ضوئياً في آبار الطبق، وقم بتغطية السطح الكامل لكل عينة بـ 500 إلى 750 µL من محلول fibronectin بتركيز 2 mg/L في PBS.يتم تحضين العينات عند 37 درجة Celsius لمدة ساعة واحدة على الأقل. وبعد التحضين، تُستخدم ماصة زجاجية لإزالة محلول fibronectine، ثم تُغسل الركائز مرة واحدة باستخدام 2 milliliters من PBS. أولاً، يتم إضافة حجم إجمالي يتراوح من 750 إلى 1,000 microliters من وسط النمو الكامل لكل بئر.بعد ذلك، يتم توزيع 15, 000 من خلايا AGK293 لكل سنتيمتر مربع من الركيزة النشطة ضوئياً في كل بئر. ثم تُحضن الخلايا لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة. يمكن زراعة الخلايا بسهولة على الركائز النشطة ضوئياً، بشرط ترسيب طبقة التصاق مناسبة، مثل fibronectin.للبدء، قم بتحضير كل من المحاليل خارج الخلوية وداخل الخلوية كما هو موضح في البروتوكول النصي المصاحب. قم بتعقيم المحاليل بتمريرها عبر مرشح مسامي بحجم 0.2 ميكرون. بعد ذلك، قم بتدفئة المحلول خارج الخلوي مسبقاً بوضعه في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C.أيضاً، املأ محقنة سعة 1 mL بالمحلول داخل الخلوي وقم بتزويدها بإبرة قياس 34-gauge. حافظ على المحلول داخل الخلوي ملامساً للثلج لتجنب تحلل ATP. بعد ذلك، خذ ركيزة مغطاة بالخلايا من الحاضنة وقم بإزالة بئر PDMS بعناية.بعد ذلك، قم بإزالة وسط النمو باستخدام ماصة زجاجية واغسل العينة ببطء باستخدام المحلول خارج الخلوي لتجنب انفصال الخلايا. أضف ثلاثة milliliters من المحلول خارج الخلوي إلى كل بئر، ثم انقل الطبق إلى حامل العينة في محطة الفسيولوجيا الكهربائية. بمجرد الاستقرار في مكانها، ضع القطب المرجعي في البئر المراد اختباره.بعد ذلك، قم بتجهيز ماصة زجاجية دقيقة جديدة لتقنية تثبيت الرقعة (patch clamp) باستخدام جهاز سحب الماصات الدقيقة. املأ نصف الماصة بالمحلول داخل الخلوي. استخدم الملاعب الدقيق (micromanipulator) لوضع ماصة الرقعة على مقربة شديدة من غشاء الخلية المختار.أثناء عملية تحديد الموضع، قم بتطبيق ضغط زائد على الماصة لتجنب التصاق الشوائب بطرفها. وعندما تكون الماصة على بُعد بضعة ميكرونات فوق الخلية، ابدأ بخفض الماصة نحو غشاء الخلية مع مراقبة مقاومة الماصة عبر برنامج التحكم في الرقعة (patch control software). وعندما تزداد مقاومة الماصة بنحو 1 megaohm، قم بإزالة الضغط الزائد وتطبيق شفط خفيف من أجل تكوين الختم العملاق (gigaseal) بين الماصة وغشاء الخلية.بعد ذلك، قم بتطبيق جهد سالب قدره 40 millivolts على الماصة للمساعدة في استقرار الختم. قم بتعويض العبور السعوي الناتج عن سعة الماصة باستخدام الأوامر ذات الصلة في مضخم الرقعة (patch amplifier) و/أو برنامج التحكم في الرقعة. طبق نبضة شفط قصيرة ومكثفة على الماصة من أجل تمزيق الغشاء والسماح بالوصول الكهربائي إلى سيتوبلازم الخلية.بعد ذلك، اضبط مضخم الرقعة (patch amplifier) على وضع تثبيت التيار (current clamp mode) بحيث لا يتم حقن أي تيار في الخلية. وفي وضع تثبيت التيار، تتبع جهد الغشاء الخلوي وانتظر بضع دقائق حتى يستقر. وبمجرد استقراره، طبق بروتوكول الإضاءة المطلوب على الخلية عن طريق إضاءة الغشاء النشط ضوئياً الموجود أسفل الخلية بضوء يتراوح طوله الموجي بين 450 و600 نانومتر.سجل تأثير الضوء على جهد الغشاء. تؤدي نبضات الضوء القصيرة التي تتراوح مدتها بين 10 إلى 20 مللي ثانية إلى إزالة استقطاب عابرة في الخلية، بينما يلاحظ حدوث فرط استقطاب مستمر عند التعرض لإضاءة مطولة تصل مدتها إلى مئات مللي الثانية، ويستمر ذلك حتى يتم إيقاف الضوء. يمكن أن يؤدي التحفيز البصري للخلايا بوساطة الركائز النشطة ضوئياً إلى تأثيرات مختلفة على غشاء الخلية، وذلك اعتماداً على مدة التحفيز الضوئي.يتبع الارتفاع الحاد والسريع، مثل ذلك الموضح هنا، زوال استقطاب عابر في حدود عشرات الملي ثانية. أما بالنسبة لنبضات الضوء القصيرة، فلوحظ سلوك معاكس عند إطفاء الضوء. وقد عُزيت هذه الإشارات إلى تغير في سعة الغشاء نتيجة التسخين الموضعي الذي يلي امتصاص الضوء.في حالة الإضاءة لفترات طويلة، يتحول إزالة الاستقطاب الأولي إلى فرط استقطاب خلوي. تعود هذه الظاهرة أيضاً إلى أصل حراري، ولكنها في هذه الحالة ترتبط بتغير في جهد توازن الغشاء نتيجة لتغير في موصلية القنوات الأيونية الناجم عن ارتفاع درجة الحرارة. ومن المهم ملاحظة أن هذه التقنية مرنة للغاية ويمكن تكييفها وفقاً للاحتياجات الخاصة بتجربة معينة، على سبيل المثال، عن طريق تغيير البوليمر السام ضوئياً، أو عملية التصنيع، أو بروتوكول الإضاءة.ومع ذلك، وقبل تغيير البروتوكول، يجب أولاً التحقق من الخصائص الهامة للبوليمر النشط، مثل توافقه الحيوي، ومدى ملاءمته لعملية التعقيم، واستقراره الكهروكيميائي والزمني. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحقيق واجهة هجينة بين البوليمرات الموصلة والخلايا الحية، وكيفية استخدامها للتحكم البصري في نشاط الخلايا. ونعتقد أن هذه التقنية تعد أيضاً بأن تصبح أداة تكميلية في العلوم العصبية للأبحاث المختبرية in vitro، وكذلك أن تفتح آفاقاً جديدة للتطبيقات الحيوية in vivo.ومع ذلك، فإن تحسين هذا البروتوكول يتطلب تضافراً قوياً للجهود بين علماء المواد وعلماء الأعصاب والفيزيائيين والأطباء.

optical-control-living-cells-electrical-activity-conjugated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام التسخين العابر المرتبط بالامتصاص البصري للقضبان النانوية الذهبية لتحفيز التمايز ونشاط الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا العصبية. من المحتمل أن تفتح هذه النتائج تطبيقات جديدة في الأطراف الاصطناعية العصبية والدراسات الأساسية في علم الأعصاب.

الذهب Nanorod بمساعدة تحفيز البصري من الخلايا العصبية

هنا ، يتم تقديم إجراء لتنشيط بروتين عصبي بشكل انتقائي بنبضة قصيرة من الضوء عن طريق ترميز حمض أميني غير طبيعي تفاعلي ضوئي وراثيا في بروتين عصبي مستهدف يتم التعبير عنه في الخلايا العصبية في الثقافة أو في الجسم الحي.

مراقبة البصرية من البروتين العصبية باستخدام حمض أميني مصطنعة مشفرة وراثيا في الخلايا العصبية

بروتوكول لتحليل المواد الهلامية التي تكونت من البصرية الإلكترونية مترافق البوليمر poly(3-hexylthiophene-2,5-diyl) (P3HT) باستخدام الصغيرة وتشتت النيوترونات زاوية صغيرة جداً سواء في وجود أو عدم وجود الإضاءة.

رصد تأثيرات الإضاءة على هيكل المواد الهلامية البوليمرية مترافق استخدام تشتت النيوترونات

نقدم هنا، بروتوكول تحليل خلية إلى نقل المعلومات متذبذبة بالتحكم أوبتوجينيتيك والعيش الرصد للتعبير الجيني. هذا النهج يوفر منبرا فريداً لاختبار دلالة وظيفية البرامج تعبير الجينات الحيوية في أنظمة متعددة الخلايا.

أسلوب أوبتوجينيتيك لمراقبة وتحليل أنماط التعبير الجيني في تفاعلات الخلية للخلية

هنا نحن نصف اكتساب البصرية وتوصيف إمكانات العمل من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المستمدة من خلايا القلب باستخدام نظام قياس ضوئي وحدات عالية السرعة.

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

يتطلب التحكم الموثوق في خلايا الثدييات المستجيبة للضوء توحيد الطرق البصرية الوراثية. ولتحقيق هذا الهدف، تحدد هذه الدراسة خط أنابيب لبناء الدوائر الجينية، وهندسة الخلايا، وتشغيل المعدات البصرية الوراثية، واختبارات التحقق لتوحيد دراسة التعبير الجيني الناجم عن الضوء باستخدام دائرة جينية بصرية وراثية سلبية كدراسة حالة.

هندسة ومراقبة الدوائر الجينية البصرية المستقرة في خلايا الثدييات بشكل موثوق

البروتوكول المعروض هنا يمكن التصنيع الآلي للخلايا الدقيقة التي توحد شكل الخلية لدراسة الهياكل الخلوية داخل خلايا الثدييات. ويمكن إنشاء هذه التقنية سهلة الاستخدام باستخدام نظم التصوير المتاحة تجاريا ولا تتطلب معدات متخصصة لا يمكن الوصول إليها في مختبرات بيولوجيا الخلايا القياسية.

السيطرة على هندسة الخلية من خلال الأشعة تحت الحمراء الليزر بمساعدة Micropatterning

هنا ، نقدم طريقة تصنيع نظام optrode مع ألياف بصرية لتوصيل الضوء ومجموعة قطب كهربائي للتسجيل العصبي. في الجسم الحي ، تظهر التجارب مع الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن قناة رودوبسين-2 جدوى النظام للتحفيز البصري الوراثي المتزامن والتسجيل الكهروفسيولوجي.

مصفوفة Optrode للتعديل البصري الوراثي المتزامن والتسجيل العصبي الكهربائي

يتضمن هذا البروتوكول نقل مستشعرات cAMP و bPAC-nLuc ، وهو بروتين بصري وراثي ، لتتبع توزيعه الخلوي واستجابته لتحفيز الضوء بدقة. ينطوي النهج المبتكر المتمثل في إنشاء خريطة استجابة cAMP باستخدام نظام مسح النقاط على إمكانية تطوير البحث باستخدام البروتينات البصرية الوراثية في مختلف المجالات.

رسم خرائط التوزيع الخلوي لبروتين بصري وراثي باستخدام شبكة تحفيز الضوء

يصف هذا البروتوكول تطبيق مجال التبديل الخيفي المنشط بالضوء الأزرق (LightR) هندسيا للتحكم الزماني المكاني القابل للانعكاس في نشاط البروتين. باستخدام Src التيروزين كيناز كنموذج ، تقدم هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا لتطوير وتوصيف Src المنظم بالضوء (LightR-Src). إنه يوضح تعدد استخدامات هذا النهج عبر فئات الإنزيمات.

التحكم الزماني المكاني لنشاط البروتين من خلال التنظيم الخيفي البصري الوراثي

يتيح استخدام الضوء للتحكم في خلايا القلب وأنسجته التحفيز غير الملامس، وبالتالي الحفاظ على الحالة الطبيعية ووظيفة الخلايا، مما يجعلها نهجا قيما لكل من التطبيقات البحثية والعلاجية الأساسية.

نظام الفيزيولوجيا الدقيقة للقلب لدراسة انتشار Ca2+ عن طريق التحفيز البصري غير الجيني

اكتشف طريقة تحفيز النشاط الكهربائي للخلايا باستخدام البوليمرات العضوية شبه الموصلة والضوء المرئي. توفر هذه التقنية بديلاً غير جراحي للتحكم في جهد غشاء الخلايا بدون الحاجة لنقل الجينات.

مراقبة البصرية من الخلايا الحية النشاط الكهربائي من قبل مترافق البوليمرات

استكشف المزيد من الفيديوهات