تحليل مقارن لهرمون النمو البشري في المصل عن طريق سبري، نانو-سبري وELISA فحوصات

الهدف العام من هذه الدراسة هو تقييم القدرة التشخيصية لمقايسات تصوير رنين البلازمون السطحي المباشر والمضخم، أو مقايسات SPRi، في الكشف عن المؤشرات الحيوية في المصل، ومقارنتها مباشرة بمجموعة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم المتاحة تجاريًا. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في المجال الطبي الحيوي، مثل تسليط الضوء على المرحلة المبكرة من المرض، وتوفير وسائل لمراقبة الفعالية العلاجية. وتتمثل الميزة الرئيسية لـ SPRi في أنها تسمح بمراقبة وتصور التفاعلات الجزيئية الحيوية في الوقت الفعلي وبدون استخدام واسمات، وذلك عن طريق تسجيل التغيرات في معامل الانكسار المتاخم لسطح المستشعر.

تمتد تداعيات هذه التقنية نحو تشخيص مستويات هرمون النمو البشري (hGH) في المصل، حيث تم ربط hGH الداخلي بالعديد من الاضطرابات الطبية التي تؤثر على النمو والتطور البشري. ويُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، لأن خطوات تحضير الكيمياء السطحية للشريحة الحيوية يصعب تعلمها، وأي خطأ قد يؤثر بشكل كبير على النتائج. بعد تحضير المحاليل وعينات البروتين وفقاً للبروتوكول النصي، استخدم 120 milliliters من محلول piranha المستقر لتنظيف الشريحة الذهبية عن طريق التنظيف بالموجات فوق الصوتية (sonication) عند 50 degrees Celsius لمدة 90 minutes.

استخدم الماء لشطف الشريحة، ثم ضعها في جهاز التنظيف بالموجات فوق الصوتية في الماء لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، اشطف الشريحة بالإيثانول واستخدم تياراً من النيتروجين لتجفيفها. ضع الشريحة الذهبية في غرفة الأوزون والأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة لإزالة أي ملوثات.

بعد ذلك، أضف 150 milligrams من حمض 11-mercaptoundecanoic إلى 20 milliliters من الإيثانول في أنبوب اختبار مزود بغطاء بلاستيكي لتوفير الدعامة للشريحة، وقضيب تحريك، لمزج المحلول بشكل متجانس. ضع الشريحة في أنبوب الاختبار وأغلقه بالغطاء. ثم قم بتسخين الأنبوب في الميكروويف بقدرة 50 watts ودرجة حرارة 50 °C لمدة خمس دقائق.

اشطف الشريحة باستخدام الإيثانول، وانقعها فيه لمدة خمس دقائق. كرر عملية الشطف باستخدام الماء، ثم انقعها لمدة خمس دقائق. أضف 150 milligrams من 1-Ethyl-3-carbodiimide إلى 20 milliliters من الماء في أنبوب اختبار يحتوي على قضيب تحريك.

انقل الشريحة إلى أنبوب الاختبار، ثم ضعها في الميكروويف كما تم توضيحه للتو. استخدم الماء لشطف الشريحة، وانقعها في الماء لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أضف 150 milligrams من N-Hydroxysuccinimide إلى 20 milliliters من الماء في أنبوب اختبار يحتوي على قضيب تحريك.

أضف الشريحة إلى أنبوب الاختبار، وأحكم إغلاقه بالغطاء، ثم ضعها في الميكروويف. بعد شطف الشريحة ونقعها في الماء كما سبق، أضف 250 micromolar من polyethylene glycol في 20 milliliters من الماء إلى أنبوب اختبار يحتوي على قضيب تحريك. أضف الشريحة وضعها في الميكروويف، ثم اشطفها وانقعها في الماء كما سبق.

قم بتحضير محلول أجسام مضادة لـ rhGH بتركيز 15 µg/mL، ومحلول anti-IgG كضابط سلبي، ثم أضف 10 µL من كل منهما إلى بئر منفصل في لوحة ذات 384 بئراً. صمم نمط التنقيط في جهاز المصفوفات الدقيقة، وباستخدام دبوس بطرف من التيفلون مقاس 500 µm، قم بتنقيط الأجسام المضادة على الشريحة. احضن الشريحة المنقطة في درجة حرارة الغرفة ورطوبة بنسبة 75% لمدة ساعتين.

بعد إعداد تجربة SPRi، وحجب الشريحة وفقاً للبروتوكول المكتوب، قم بتحضير محلول من rhGH بمجموعة التركيزات التالية في PBS، الذي يحتوي على 10% serum، و1 mg/mL من BSA. ومن المهم التأكيد على نوع جزيء الحجب المختار في هذه الخطوة، حيث إن الهدف هو تقليل التفاعلات غير النوعية.

قم بتحضير محلول بنسبة اثنين إلى واحد عن طريق إضافة 1 µL من أجسام مضادة كاشفة لـ anti-rhGH موسومة بالبيوتين بتركيز 6 µM إلى 3 µL من نقاط كمية بالأشعة تحت الحمراء القريبة مغلفة بالستربتاديفين بتركيز 1 µM في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 mL. احقن 150 µL من محلول مصل بشري مضاف إليه hGH في حلقة الحقن. ستتبع الزيادة القوية في الإشارة عملية انخفاض بطيئة ناتجة عن شطف المصل المرتبط بشكل غير محدد من على السطح.

بمجرد استقرار الإشارة، استخدم محلولاً من كلوريد الصوديوم بتركيز 450 millimolar، يُضاف إلى محلول التشغيل (running buffer)، لغسل السطح. وباستخدام محلول التشغيل، خفف محلول الأجسام المضادة للكشف عن anti-rhGH والنقاط الكمومية (quantum dots) إلى تركيز 10 nanomolar، ثم احقنه في خلية التدفق. استورد البيانات إلى برنامج لتحليل البيانات.

بعد ذلك، قم برسم إشارة SPRi مقابل الوقت، وحدد الفرق بين بقع الأجسام المضادة anti-rhGH وبقع الأجسام المضادة الضابطة السلبية بعد عملية الغسل بالملح عالي التركيز. ولإجراء اختبار ELISA، بعد تحضير الكاشفات والآبار المطلية بالأجسام المضادة والمعايير وفقاً للبروتوكول النصي، قم بتحضير عينات هرمون rhGH في مصل بشري بتركيز 10% بالتراكيز التالية. أضف 50 µL من كل معيار وعينة ضابطة وعينة إلى كل بئر في ثلاث مكررات.

بعد ذلك، قم بإغلاق الآبار بإحكام، وحضنها عند درجة حرارة 4 °C مع الرج الخفيف طوال الليل. وفي اليوم التالي، أخرج الطبق من جهاز الرج، واتركه حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. قم بتدفئة anti-rhGH HRP، ومحلول conjugate buffer، ومحلول wash buffer، والمادة الملونة tetramethylbenzidine أو TMB، ومحلول stop reagent حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.

لتحضير الكواشف العاملة، استخدم محلول منظم الاقتران لعمل تخفيف بمقدار 40x من anti-rhGH HRP. استخدم الماء المقطر لتخفيف محلول الغسيل بمقدار 200x. أضف 50 µL من مترافق anti-rhGH HRP في كل بئر.

أحكم إغلاق الآبار، ثم قم بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع الرج الخفيف. صب المحلول من الآبار، ثم اقلب الطبق، واربته للتجفيف على ورق ماص. أضف 200 microliters من محلول الغسيل إلى كل بئر، قبل الصب والتربيت للتجفيف مرة أخرى.

كرر عملية الغسل ثلاث مرات. من المهم النقر على طبق الـ 96-well لإزالة العوامل المساعدة، حيث إن الاعتماد على الماصة ليس فعالاً. بعد ذلك، أضف 100 µL من المادة الملونة في كل بئر، خلال 15 دقيقة بعد خطوة الغسل.

يتم التحضين في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام لمدة 30 دقيقة مع الرج اللطيف. ستتحول المحاليل عديمة اللون إلى اللون الأزرق. أضف 100 µL من كاشف الإيقاف إلى كل بئر.

سوف تتحول المحاليل من اللون الأزرق إلى اللون الأصفر. استخدم قارئ الأطباق عند 450 نانومتر لقراءة الامتصاصية لكل بئر على الفور. وأخيرًا، ارسم المنحنى القياسي للمعايرات المقدمة، ثم ارسم الكثافة الضوئية لـ rhGH في عينات مصل بتركيز 10% مقابل تركيز كل عينة.

في هذا الفيديو، تمت مقارنة أداء تقنيتي SPRi و nano-SPRi مع تقنية ELISA للكشف عن rhGH. يمثل هذا الشكل منحنى التعيير لـ rhGH المضاف إلى مصل بشري بتركيز 10%، وهو مرسوم مقابل قيمة OD التي تم الحصول عليها عند 450 نانومتر. لُوحظ استجابة خطية جيدة، وتم تحديد حد الكشف ليكون 1 نانوغرام لكل ملليلتر.

هنا، تم تقييم الكشف عن rhGH باستخدام تقنية SPRi. تمثل كل نقطة على منحنى تدرج التركيز القيمة المتوسطة لفرق الانعكاس المحسوب من ثلاثة منحنيات حركية لتقنية SPRi لكل تركيز. وقد تم تحديد حد الكشف، أو LoD، ليكون 3.61 nanograms per milliliter.

لزيادة حساسية المستشعر الحيوي القائم على رنين البلازمون السطحي التصويري (SPRi)، تم إدخال مُعززات نانوية إلى المستشعر بالتتابع. وفي هذه التجربة، ضخمت المُعززات النانوية استجابة المستشعر الحيوي بنسبة تصل إلى 7.9%، ومع ذلك، كان التغيير في الإشارة ضئيلاً بالنسبة لعينة التحكم. كما تم تقييم القابلية التطبيقية للمستشعر الحيوي النانوي (nano-SPRi) من خلال قياس نطاق تركيز rhGH من 30,000 إلى 0.25 picograms per milliliter.

تم حساب حد الكشف (LoD) ليكون 9.2 picograms per milliliter، وكان معامل التباين 20%. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إجراؤها في ساعة واحدة للكشف المباشر، وساعتين لتقنية nano-SPRi، إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر تحسين الظروف لكل خطوة، وبعد القيام بذلك، يمكن تكرار النتائج بسهولة في مدة زمنية أقصر. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل multi-tuff وmaspeck analysis مباشرة على الشريحة بعد تجربة SPRi، وذلك لتزويدك برؤى إضافية حول الجزيء الذي تم التقاطه.

بعد تطويرها، من شأن هذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجال التشخيص الطبي لاستكشاف الكشف المتزامن عن مؤشرات حيوية متعددة مرتبطة بالأمراض السرطانية والعصبية وأمراض القلب والأوعية الدموية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد مقاييس SPRi و nano-SPRi و ELISA للكشف عن مستويات hGH في المصل البشري. لا تنسَ أن العمل مع الكواشف قد يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء القفازات ونظارات الحماية عند تنفيذ هذا الإجراء.