استراتيجية للتحقق من دور بوساطة Callose Plasmodesmal المحاصرة في الاستجابة مدار

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص الجينات المشاركة في البوابات البلازمية بوساطة الكالس أثناء الاستجابة الاستوائية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا نمو النبات ، مثل الجينات غير المعروفة التي تتحكم في الإشارات من خلية إلى أخرى بواسطة plasmodesmata أثناء الاستجابة الاستوائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة وتعمل أيضا وتكرر.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن التعامل مع نبات الأرابيدوبسيس المسبب للهيبوكوتيل دون أي ضرر أثناء العملية برمتها يمثل تحديا. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نضع قاعدة GSL8 ، وهو سينسيز الجلوكوز في البوابات البلازمية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن الإجراءات المذكورة في الصوت لم توضح الخطوات الحرجة التي يصعب تنفيذها لأنها تحتاج إلى إعداد ومعالجة خاصة.

قم بإعداد Murashige و Skoog ، أو وسط MS ، قبل يوم واحد من التجربة. قم بالتعقيم ، واملأ الألواح المربعة 125 ملم ب 50 مل من الوسائط لكل لوحة. في اليوم التالي ، قم بتقطيع البذور التي تم تعقيمها بنسبة 1.1٪ هيبوكلوريت الصوديوم على أطباق شبه مجففة.

من طرف ماصة دقيقة 1 ملم ، قم بتقطيع البذور ب 200 ميكرولتر من الماء. رتب البذور في خمسة صفوف ، على بعد 1.8 سم ، بحيث تكون البذور على بعد 0.1 سم على الأقل في الصفوف. دع بعض الماء يتبخر قبل تغطية الألواح وإغلاقها بشريط جراحي.

ثم لف الأطباق بورق القصدير وضعها داخل صندوق. احتضن الصندوق عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة أيام. بعد ثلاثة أيام من المعالجة الباردة ، انقل علبة البذور إلى 22 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.

بعد ثلاثة أيام أخرى ، في غرفة مظلمة ، تحقق من حالة إنبات البذور تحت الضوء الأخضر. عادة ، تنمو شتلات Col-0 البالغة من العمر ثلاثة أيام حتى يصل طولها إلى 1.6 سم. تحت الضوء الأخضر ، قم بتحليل الاستجابة الضوئية والجاذبية المتغيرة.

باستخدام معول معقم ، حدد شتلات ذات حجم مماثل مع نمو رأسي مستقيم. ارفع الشتلات برفق من الجزء السفلي من hypocotyl دون لمس أي أجزاء أخرى. بعد ذلك ، انقل الشتلات المختارة بعناية إلى لوحة أجار MS جديدة.

على اللوحة الجديدة ، قم بتوجيه خطافات الشتلات بنفس الطريقة. حدد ما لا يقل عن 20 شتلة من كل خلفية وراثية لعمل كل صف ، وقم بعمل نسخة طبق طبق مكررة من كل لوحة. تحتوي كل صفيحة على نمطين وراثيين في صفين.

للتحقق من الاستجابة الضوئية ، ضع الألواح في صندوق أسود بحيث يتم توجيه الشتلات عموديا. اترك جانبا واحدا من الصندوق مفتوحا على حافة الألواح. ثم احتضان الصندوق في غرفة نمو النبات بضوء أبيض أحادي الجانب.

للتحقق من الاستجابة الجاذبية ، لف الألواح بورق الألمنيوم وضعها في صندوق أسود بحيث تكون الشتلات أفقية. في عدة نقاط زمنية ، تبدأ عادة من 90 دقيقة وتمتد إلى 12 ساعة ، قم بتصوير اللوحات في ظروف الإضاءة المنخفضة. استخدم مجموعة ماسحات ضوئية لجمع صور JPEG بدقة 600 نقطة في البوصة.

لقياس زاوية الانحناء للشتلات ، قم بتحميل صورها في برنامج ImageJ. استخدم أداة التكبير للتكبير ، وقم بالتمرير إلى الشتلات لتحليلها. ثم استخدم أداة الزاوية لقياس الزاوية التي تنحني بها الشتلات.

للقيام بذلك ، انقر نقرا مزدوجا بزر الماوس الأيسر على نقطة اتجاه نمو hypocotyl الأصلية A ، واسحب الماوس إلى نقطة بدء الانحناء B ، ثم استخدم النقر بزر الماوس الأيسر لرسم السطر الأول. الآن ، اسحب الماوس من النقطة B إلى نهاية الانحناء ، النقطة C ، واستخدم النقر بزر الماوس الأيسر لرسم الخط الثاني ، لتشكيل زاوية ، A. زاوية الانحناء الحقيقية هي الزاوية B ، والتي تساوي 180 درجة ناقص الزاوية A. الآن ، قم بقياس وتسجيل الزاوية A بالضغط على M على لوحة المفاتيح. سيتم فتح ملف النتائج بشكل منفصل.

كرر الخطوة السابقة لقياس باقي الشتلات ، وقم بقياس متوسط زاوية خلفيتين مختلفتين باستخدام ملف جدول بيانات مجموعة البيانات. يتم تغطية إعداد كتل HPTS agarose اللازمة لهذا الاختبار في بروتوكول النص. ابدأ بتحضير عينات النبات.

في هذا المثال، يتم تحليل الطفرات ذات حد استبعاد حجم البلازموديسماتا المتغير. أولا ، قم بإنشاء منصة للمقايسة. ضع شريحة غطاء المجهر على لوحة متوسطة جديدة للتصلب المتعدد.

بعد ذلك ، من ألواح MS ذات الشتلات الكريمة التي يبلغ عمرها ثلاثة أيام ، استخدم مقصا جراحيا حادا لاستئصال الشتلات بعناية من قاعدة الخطاف ، ونقلها إلى زجاج الغطاء. نقل ما لا يقل عن خمس شتلات لكل خلفية جينية. قم بتوجيه الشتلات بحيث يبقى 0.5 سم فقط من hypocotyl من موضع الاستئصال على شريحة الغطاء ويلامس باقي hypocotyl الوسط.

بعد ذلك ، ضع كتلة HPTS agarose فوق الشتلات المقطوعة بحيث تكون المنطقة المقطوعة على اتصال بكتلة HPTS. تأكد من إجراء الاتصال. دع الكتلة تجلس على hypocotyls لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، انقل hypocotyls إلى طبق بتري مقاس 10 ملم يحتوي على ماء مقطر مزدوج ، واغسلها بالرج لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، انقل الشتلات المغسولة إلى شريحة. ضع كل متحولة بجوار عنصر تحكم لإجراء مقارنات مباشرة.

قم بتغطية hypocotyls ب 100 إلى 150 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج وقم بتطبيق شريحة غطاء. الآن ، قم بتحليل الشريحة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر كما هو موضح في بروتوكول النص. لهذا الاختبار ، استخدم صبغة محضرة حديثا يقل عمرها عن يومين وتحفظ في الظلام.

لتثبيط تخليق الكالوز من جديد ، أضف 1.5 مللي مولار من 2-Deoxy-D-glucose إلى الصبغة. ابدأ هذا الاختبار عن طريق اختيار شتلات مبطنة عمرها ثلاثة أيام لتلوين الكالوز ، مع أو بدون استجابة استوائية. قطع الشتلات من منطقة الخطاف باستخدام مقص جراحي رفيع.

ثم ، باستخدام طرف عود أسنان ، انقل الشتلات في طبق بتري صغير يحتوي على ملليلترين من المخزن المؤقت للتلطيخ. احتضان الشتلات في مخزن التلوين في الظلام لمدة ساعتين مع الاهتزاز المستمر عند 30 دورة في الدقيقة. بعد التلوين ، اغسل الشتلات بالماء المقطر المزدوج لمدة دقيقتين لإزالة المخزن المؤقت الزائد للتلطيخ.

بمجرد غسلها ، حدد خمس شتلات على الأقل من كل خلفية للتحليل متحد البؤر. قم بقياس شدة إشارة callose باستخدام برنامج ImageJ. افتح ملف المجهر متحد البؤر المحفوظ بالفعل بتنسيق JPEG في برنامج التصوير.

بعد ذلك ، باستخدام أداة التحديد المستطيل ، اسحب المؤشر فوق الصورة ، وحدد المنطقة المراد فحصها. بعد ذلك ، قم بقياس وتسجيل القيم العددية لشدة الإشارة بالضغط على M.سيتم فتح ملف النتائج بشكل منفصل. في ملف النتائج ، يشير مصطلح المتوسط إلى شدة الإشارة للمنطقة المحددة ، وليس متوسط عدة مناطق.

واحدة تلو الأخرى ، قم بتحليل الإشارة بهذه الطريقة لكل شتلة. كرر الخطوة أعلاه لقياس باقي الشتلات ، وقم بقياس متوسط زاوية خلفيتين مختلفتين باستخدام ملف جدول بيانات مجموعة البيانات. باستخدام البروتوكولات الموصوفة ، تم تحليل خطوط RNAi المحفزة لديكساميثازون ل AtGSL8.

من الواضح أن شتلات DsGSL8 كانت معيبة في الانتحاء الضوئي والجاذبية. لم يظهروا أي انحناء تحت تأثير أي من القوتين. أظهرت التعديلات في الحركة السمبلزية أن حركة صبغة HPTSA كانت أكثر شمولا في ضربة قاضية dsGSL8 RNAi مقارنة بأي من عناصر التحكم.

كالوز هو أحد المنظمين الرئيسيين لحد استبعاد حجم plasmodesmata ، و AtGSL8 هو سينسيز plasmodesmata callose معروف. لذلك ، تم تنفيذ تلطيخ كالوز أنيلين الأزرق. في عنصر التحكم ، تراكمت الكالوز بعد ست ساعات ، كما هو موضح بالسهام الصفراء.

ومع ذلك ، بعد ست ساعات ، كان لدى الطفرات مستويات منخفضة باستمرار من plasmodesmata callose . كان هذا الغياب لتخليق الكالوز أقل بشكل ملموس بعد ثلاث ساعات من الانتحاء الضوئي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء فحص سريع للجينات في المتغير الذي يتحكم في البوابات البلازمية بسبب الاستجابة الاستوائية من خلال تعديل الكالف البحت.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي ست ساعات بعد ثلاثة أيام'إنبات شتلات نبات الأرابيدوبسيس. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب إتلاف الشتلات أثناء نقلها. أيضا ، من المهم إجراء اتصال مناسب بين الأجار والهيبوكوتيل أثناء فحص التحميل.

بعد هذا التطور ، مهدت هذه التقنية الطريق لعلم الأحياء التنموي لاستكشاف الجينات ، الجينات الجديدة ، التي تلعب دورا في التحكم في الموصلية التماثلية أثناء المناطق الاستوائية