في وقت واحد ثنائي الفوتون في فيفو تصوير متشابك المدخلات والأهداف بعد المشبكي في اللحاء ماوس خلف الطحال

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية الموضحة أدناه من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية في معهد نينسكي لعلم الأحياء التجريبي ، الأكاديمية البولندية للعلوم. يوضح هذا الفيديو إجراء حج القحف الذي يسمح بالتصوير المزمن للخلايا العصبية في قشرة خلف الطحال للفأر باستخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون في الجسم الحي في هذا الخط المعدل وراثيا للقدمين. يتم الجمع بين هذا النهج مع حقن mCherry الذي يعبر عن الفيروس المرتبط بالغدة ، AAV ، في الحصين الظهري.

هذه التقنيات معا بمراقبة طويلة الأمد للاعتماد من ذوي الخبرة ، واللدونة الهيكلية في القشرة خلف الطحال. في هذه الورقة ، نقترح زرع نافذة الجمجمة فوق القشرة خلف الطحال باعتبارها منطقة اهتمام محتملة للفحص المجهري ثنائي الفوتون في الجسم الحي. من أجل تصور التغيرات المورفولوجية في الهياكل العصبية ، نستخدم هذا الواحد من الفئران البائية مع التعبير عن بروتين GFP الفلوري في ما يقرب من 10 في المائة من الخلايا العصبية في الدماغ.

ابتكار آخر نقترحه هو حقن AAV ، وهو تعبير عن بروتين فلوري mCherry تحت محفز خاص بالخلايا العصبية في الهياكل العميقة في الدماغ ، مثل الحصين ، من أجل تصور إسقاطات الهيكل في القشرة خلف الطحال. تعقيم جميع الأدوات والحاويات الزجاجية للسوائل ومسحات القطن في الأوتوكلاف. أنت قفازات يمكن الاستغناء عنها.

نظف الطاولة الجراحية والإطار التجسيمي وجميع المناطق المحيطة بها بنسبة 70٪ من الإيثانول. استخدم وسادة جراحية معقمة لإنشاء مساحة معقمة لجميع المعدات المعقمة. قطع رغوة الجل إلى قطع صغيرة ونقعها في محلول ملحي معقم.

ضع في غرفة الحث واضبط مستوى الأيزوفلوران على 5٪ وتدفق الأكسجين إلى لترين في الدقيقة. يجب أن يستغرق هذا الإجراء حوالي ثلاث دقائق. أخرج من غرفة الحث.

استخدم قرصات الذيل أو إصبع القدم للتأكد من أن مخدر بالكامل. باستخدام أدوات تشذيب دقيقة ، احلق الشعر من مؤخرة الرأس ، بين الأذنين ، حتى العينين. ضع في الإطار التجسيمي وقم بتثبيت الرأس بقضبان الأذن.

اضبط مستويات التخدير على 1.5 إلى 2٪ إيزوفلوران ونقطة صفر ثلاثة لترات في الدقيقة من الأكسجين. ضع مرهم العين. حقن تحت الجلد مع تولفيدين ، أربعة ملليغرام لكل كيلوغرام ، بوتوميدور ، ملليغرامان لكل كيلوغرام ، وبايتريل ، خمسة ملليغرام لكل كيلوغرام لمنع الالتهاب والألم والعدوى على التوالي.

حقن في العضل مع ديكساميثازون ، نقطة صفر ملليغرام لكل كيلوغرام ، لمنع تورم الدماغ. نظف البشرة باستخدام مسحات قطنية معقمة مع البيتادين متبوعا بنسبة 70٪ إيثانول. قم بتغيير القفازات ورشها بنسبة 70٪ من الإيثانول.

ارفعي الجلد بالملقط وباستخدام مقص دقيق ، شق الجلد أفقيا على طول قاعدة الرأس ثم بشكل غير مباشر إلى النقطة الأمامية بين العينين. قم بإزالة سديلة الجلد. ضع مرهم الليدوكائين بمسحة معقمة على السمحاق لمنع النزيف المفرط والألم.

استخدم مسحات قطنية معقمة أو مشرط لإزالة السمحاق. جفف الجمجمة بمسحات معقمة. باستخدام إبرة معقمة ، ضع غراء سيانواكريليت كثيف على حواف الجلد لتثبيتها ومنع المزيد من ملامسة الأسمنت الأسنان.

انتظر حتى يجف الغراء. ضع زجاجا معقما بحجم ثلاثة ملليمترات فوق الجمجمة من الأمام إلى خياطة لامدويد. توسيط زلة الغطاء عند إحداثيات خلف الطحال, أمامي, الخلفي بريجما ناقص نقطتين ثمانية, بريجما جانبي وسطي صفر.

ضع علامة على حواف انزلاق الغطاء عن طريق خدش سطح الجمجمة بإبرة معقمة. ضع زجاج الغطاء مرة أخرى في الحاوية المعقمة مع 70٪ من الإيثانول. استخدم مثقاب أسنان عالي السرعة مع بر صغير القطر لتحديد دائرة قطرها ثلاثة ملليمترات.

نظف موقع الحفر من غبار العظام باستخدام مسحات معقمة ذات رؤوس ملحية. استخدم رغوة الجل والمسحات لوقف النزيف العرضي وتنظيف العظام. بين الحفر ، تحقق من سمك العظم باستخدام ملقط دقيق عن طريق لمس دائرة العظام برفق والتحقق من حركتها.

مع الأخذ في الاعتبار أن العظم أكثر سمكا في منطقة الغرز. أوقف الحفر عندما تكون دائرة العظام متحركة ولا تترك سوى طبقة رقيقة من العظام على المحيط. نظف المجال التشغيلي من جميع غبار العظام المتبقية باستخدام مسحات ذات رؤوس ملحية.

قم بإسقاط المحلول الملحي المعقم على منطقة الحفر ، وتغطي الدائرة المحفورة. قم بإزالة دائرة العظام بعناية باستخدام ملقط ناعم ثم قم بإزالة العظم برفق ولكن بثبات عن طريق رفعه لأعلى. احرص على عدم تحريف الدائرة العظمية أثناء رفعها لمنع التلف المحتمل للجافية.

ضع رغوة الجل المنقوعة في محلول ملحي معقم برفق على الجافية للمساعدة في التغلب على النزيف. انتظر حتى يتوقف كل النزيف تماما. قم بإزالة رغوة الجل بعناية حتى لا تزعج عملية التخثر.

لاحظ أن منطقة الخياطة عالية الأوعية الدموية ، لذا قد يكون النزيف في هذه المرحلة عميقا. من الضروري انتظار الوقت الكافي لتوقف النزيف. قم بتوصيل مضخة التسريب بالبرج التجسيمي وقم بتوصيل وحدة التحكم.

أدخل الإبرة 35 مقياسا في حقنة التعبئة. اغسل المحقنة 10 مرات بالإيثانول لتعقيمها و 10 مرات بمحلول ملحي معقم لإزالة آثار الإيثانول. قم بإزالة فقاعات الهواء من المحقنة.

أدخل المحقنة في المضخة. املأ جرعة واحدة من مستحضر AV واحتفظ بها على الثلج. املأ المحقنة بمحلول الفيروسات.

قم بتوسيط الإبرة على بريجما ثم أدخلها برفق في الحصين باستخدام الإحداثيات التالية: الأمامي ، الخلفي ناقص اثنين ، الجانبي الإنسي زائد ناقص واحد ، البطني الظهري ناقص واحد. ستكون هذه الإحداثيات بالقرب من حافة مجال الجمجمة. انتظر لمدة خمس دقائق حتى تستقر الأنسجة.

حقن نقطة صفر سبعة ميكرولتر من محلول AV بمعدل 50 نانولتر في الدقيقة. انتظر 10 دقائق حتى يمتص الفيروس بالكامل. قم بإزالة الإبرة برفق.

لطخة برغوة الجل في حالة حدوث نزيف. كرر مع الجانب المقابل. ضع زجاج الغطاء الجاف المعقم على الجزء العلوي من الجافية في إطار الدائرة المحفورة.

أمسك زجاج الغطاء بالأمامات لتسطيح الجافية برفق وتقريب حواف زجاج الغطاء من سطح الجمجمة. باستخدام إبرة معقمة ، ضع غراء سيانواكريليت الكثيف على الحواف الزجاجية للغطاء لتثبيتها بالجمجمة. انتظر حتى يجف الغراء.

ضع قضيب تثبيت أو صمولة أنطون أو تصميما مخصصا في الجزء الأمامي من الجمجمة. لاحظ أنه يجب وضع شريط التثبيت في وضع يتيح الوضع الأفقي لنافذة الجمجمة أثناء جلسة التصوير. ضع الغراء على حواف الشريط.

انتظر حتى يجف الغراء. لاحظ أنه يجب وضع شريط التثبيت بعيدا قدر الإمكان عن النافذة. إذا تم وضعه بالقرب من النافذة ، فقد يشكل الشريط والمسمار الذي يربطه بالحامل المخصص عقبة أمام الهدف أثناء عملية التصوير.

تحضير أكريليك الأسنان وتطبيقه على سطح الجمجمة حول الزجاج. من المفيد تشكيل شكل يشبه الحفرة حول النافذة. سيخلق تجويفا للمياه المطبقة لاحقا للتصوير بهدف الماء.

قم بإنشاء غطاء مع أكريليك الأسنان ، يغطي بقية منطقة التشغيل شريط تثبيت حواف الجلد لإعادة تعزيز الحفرة حول نافذة الجمجمة. انتظر حتى يتصلب الأسمنت الأسنان. قم بإزالة من الإطار التجسيمي وضعه في غرفة الاسترداد.

انتظر حتى يتعافى من الجراحة مع مراقبة الوظائف الفسيولوجية. تطبيق التخدير بعد الجراحة سيروبروفيرين ، 10 ملليغرام لكل كيلوغرام ، والمضادات الحيوية العلاج بايتريل ، خمسة ملليغرام لكل كيلوغرام ، لمدة 48 ساعة. ابدأ ليزر ti sapphire ، قم بتشغيل المجهر.

تم تجهيز النظام المستخدم في هذه التجربة بليزر ثنائي الفوتون ونظام OPO و PMT مزيف ثنائي الغاليوم زرنيخيد. ضع في غرفة الحث وحث التخدير. أخرج من غرفة الحث وضعه في قناع التخدير بالغاز تحت المجهر.

قلل تدفق الأكسجين إلى نقطة الصفر ثلاثة لترات في الدقيقة وتركيز الأيزوفلوران إلى 1.52٪ قم بتثبيت على إطار المجهر المخصص باستخدام برغي MT أو نظام مخصص آخر. تسوية نافذة الجمجمة. لاحظ أنه من الممكن استخدام نظام تثبيت الرأس الخاص بالشركة المصنعة للمجهر ، على الرغم من أن الإطار المخصص المحدد يعطي نتائج أفضل ، وثباتا محسنا للرأس ، ووضعا ثابتا في جلسات متعددة أثناء تجربة مزمنة.

باستخدام إعدادات المجهر واسع المجال ، وهو هدف تكبير منخفض ، قم بتوسيط العرض على أحد جوانب القشرة خلف الطحال وركزها على سطح انزلاق الغطاء. ضع قطرة من الماء في بئر الأكريليك الشبيه بالحفرة. قم بالتبديل إلى هدف الغمر في الماء لمسافات طويلة.

حرك الهدف نحو نافذة الجمجمة حتى يربط الغضروف المفصلي المائي العينة والهدف. قم بالتبديل إلى إعدادات الفوتونين وابدأ في مسح العينة من أعلى إلى أسفل باستخدام أقل تكبير. سيكون عبور مادة الجافية مرئيا على شكل وهج لإشارة عالية غير محددة.

اضبط إعدادات الحصول على المجهر في كلتا القناتين ، GFP و mCherry وفقا لقوة الإشارة من خلايا الفلورسنت من أجل تغطية النطاق الديناميكي بالكامل. بعد العثور على خلية عصبية مناسبة مع فصل الشجرة المتغصنة عن الخلايا الأخرى ، قم بإجراء فحص أولي باستخدام مرشحات GFP فقط التي تم ضبطها بأقل تكبير ومسافة Z تبلغ خمسة ميكرون. احصل على الحد الأقصى من الإسقاط لمكدس المسح الضوئي واطبعه للتعليقات التوضيحية باستخدام الألوان المقلوبة.

اضبط التكبير على قيمة تسمح بتصوير التفاصيل المورفولوجية المطلوبة. قم بتصوير الشجرة المتغصنة بأكملها في قناة GFP و mCherry باستخدام الحد الأقصى للإسقاط كدليل. باستخدام هذا البروتوكول ، سيكون من الممكن مراقبة كل من الهياكل قبل وبعد التشابك بشكل متكرر في القشرة خلف الطحالية.

يمكن استخدام هذا النهج مع تجربة مزمنة حيث من المتوقع أن ترتبط التلاعبات السلوكية عند التغيرات في مورفولوجيا التشعبات أو العمود الفقري المشبكي أو النيوترونات قبل التشابكية. يمكن إجراء جلسات التصوير بأي تردد ، ولكن يفضل الفاصل الزمني لمدة 24 ساعة للسماح بالشفاء السليم للحيوان وتقليل تأثير التخدير. إذا تم تطبيقها بشكل صحيح ، فإن هذه التقنية تسمح بإجراء جلسات تصوير متعددة على مدار عدة أشهر.