في وقت واحد ثنائي الفوتون

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية الموضحة أدناه من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية في معهد نينسكي للبيولوجيا التجريبية، الأكاديمية البولندية للعلوم. يوضح هذا الفيديو إجراء عملية ثقب الجمجمة التي تسمح بالتصوير المزمن للعصبونات في القشرة خلف الطحالية للفأر باستخدام مجهر الفوتونين الحي في السلالة المعدلة وراثياً thi one-G of feet. ويقترن هذا النهج بحقن فيروس مرتبط بالغدية، AAV، يعبر عن mCherry في الحصين الظهري.

تسمح هذه التقنيات، عند دمجها معاً، بالمراقبة طويلة المدى للاعتماد المكتسب واللدونة الهيكلية في القشرة خلف المرفقية. ونقترح في هذه الورقة أن زرع النافذة القحفية فوق القشرة خلف المرفقية يمثل منطقة اهتمام ممكنة للفحص المجهري الحي ثنائي الفوتون. ومن أجل تصور التغيرات المورفولوجية في البنى العصبية، نستخدم فئران B من سلالة one-G التي تعبر عن بروتين GFP الفلوري في حوالي 10 بالمئة من الخلايا العصبية في الدماغ.

ابتكار آخر نقترحه هو حقن AAV، يعبر عن البروتين الفلوري mCherry تحت محفز خاص بالخلايا العصبية في البنى العميقة في الدماغ، مثل hippocampus، وذلك من أجل تصور الإسقاطات من هذه البنية إلى القشرة خلف الشقّية. قم بتعقيم جميع الأدوات، والحاويات الزجاجية للسوائل، والمسحات القطنية في جهاز التعقيم (autoclave). ارتدِ القفازات التي تستخدم لمرة واحدة.

قم بتنظيف طاولة الجراحة، والإطار التجسيمي، وجميع المناطق المحيطة باستخدام ethanol بتركيز 70%. استخدم وسادة جراحية معقمة لإنشاء مساحة معقمة لجميع المعدات المعقمة. قم بتقطيع الرغوة الهلامية (gel foam) إلى قطع صغيرة ونقعها في محلول ملحي معقم.

ضع الحيوان في غرفة التحريض واضبط مستوى الإيزوفلوران على 5% وتدفق الأكسجين على لترين في الدقيقة. يجب أن تستغرق هذه العملية حوالي ثلاث دقائق. أخرج الحيوان من غرفة التحريض.

استخدم قرصات الذيل أو أصابع القدم للتأكد من تخدير الحيوان بشكل كامل. وباستخدام مقصات دقيقة، قم بحلاقة الشعر من مؤخرة الرأس، بين الأذنين، وصولاً إلى العينين. ضع الحيوان في الإطار المجسم (stereotactic frame) وثبت الرأس باستخدام قضبان الأذن.

اضبط مستويات التخدير على 1.5 إلى 2% isoflurane و 0.3 لتر في الدقيقة من الأكسجين. ضع مرهم العين. احقن الحيوان تحت الجلد بـ tolfedine بجرعة 4 ملغ/كغ، و butomidor بجرعة 2 ملغ/كغ، و Baytril بجرعة 5 ملغ/كغ للوقاية من الالتهاب والألم والعدوى على التوالي.

يُحقن الحيوان عضلياً بالديكساميثازون، بجرعة 0.2 mg/kg، لمنع تورم الدماغ. يتم تنظيف الجلد باستخدام مسحات قطنية معقمة مبللة بالبيتادين، يليه الإيثانول بتركيز 70%. يتم تغيير القفازات ورشها بالإيثانول بتركيز 70%.

ارفع الجلد باستخدام الملقط، واستخدم مقصات مجهرية لإجراء شق جلدي أفقي على طول قاعدة الرأس، ثم بشكل مائل باتجاه النقطة الأمامية بين العينين. قم بإزالة السديلة الجلدية. ضع مرهم الليدوكائين باستخدام مسحة معقمة على السمحاق لمنع النزيف المفرط والألم.

استخدم مسحات قطنية معقمة أو مشرطاً لإزالة السمحاق. جفف الجمجمة باستخدام مسحات معقمة. وباستخدام إبرة معقمة، ضع غراء سيانوأكريليت كثيفاً على حواف الجلد لتثبيتها ومنع ملامستها لملاط الأسنان.

انتظر حتى يجف الغراء. ضع شريحة غطاء معقمة بسمك ثلاثة مليمتر فوق الجمجمة في موضع أمامي بالنسبة للدرز اللامي. قم بتوسيط شريحة الغطاء عند إحداثيات المنطقة خلف المخططية، حيث تكون الإحداثيات الأمامية والخلفية من نقطة البريغما -2.8، والإحداثيات الإنسية والوحشية من نقطة البريغما 0.

حدد حواف غطاء الشريحة عن طريق خدش سطح الجمجمة بإبرة معقمة. أعد غطاء الزجاج إلى الوعاء المعقم الذي يحتوي على 70%ethanol. استخدم مثقاب أسنان عالي السرعة مع لقمة صغيرة القطر لرسم دائرة بقطر ثلاثة مليمتر.

قم بتنظيف موقع الحفر من غبار العظام باستخدام مسحات معقمة مبللة بالمحلول الملحى. استخدم الرغوة الهلامية (gel foam) والمسحات لإيقاف النزيف العارض وتنظيف العظم. وبين عمليات الحفر، تحقق من سمك العظم باستخدام ملقط دقيق عن طريق لمس دائرة العظم برفق والتحقق من مدى حركيتها.

مع مراعاة أن العظم يكون أكثر سماكة في منطقة الغرز. توقف عن الحفر عندما تصبح الدائرة العظمية متحركة وتبقى طبقة رقيقة ومنتظمة من العظم فقط على المحيط. قم بتنظيف مجال العمل من جميع بقايا غبار العظم باستخدام مسحات مبللة بالمحلول الملحي.

ضع المحلول الملحي المعقم على منطقة الثقب، بحيث يغطي الدائرة المثقوبة. ارفع دائرة العظم بعناية باستخدام ملقط دقيق، ثم قم بإزالة العظم بلطف ولكن بحزم عن طريق رفعه إلى الأعلى. احذر من إمالة دائرة العظم أثناء رفعها لمنع حدوث تلف محتمل للأم الجافية.

ضع بلطف إسفنج الجيلاتين المبلل بمحلول ملحي معقم على الأم الجافية للمساعدة في وقف النزيف. انتظر حتى يتوقف النزيف تماماً. قم بإزالة إسفنج الجيلاتين بعناية حتى لا يتم تعكير عملية التجلط.

ملاحظة، تتميز منطقة الخياطة بتروية دموية عالية، لذا قد يكون النزيف في هذه المرحلة غزيراً. من الضروري الانتظار لفترة كافية حتى يتوقف النزيف. قم بتثبيت مضخة التسريب في البرج التجسيمي وتوصيل وحدة التحكم.

أدخل الإبرة عيار 35 في سرنجة التعبئة. اشطف السرنجة 10 مرات باستخدام الإيثانول لتعقيمها، و10 مرات بمحلول ملحي معقم لإزالة آثار الإيثانول. تخلص من فقاعات الهواء الموجودة في السرنجة.

أدخل المحقنة في المضخة. قم بتعبئة جرعة واحدة من تحضير AV واحفظها على الثلج. املأ المحقنة بمحلول الفيروس.

قم بتمركز الإبرة فوق منطقة البريغما (bregma)، ثم أدخلها برفق في الحصين (hippocampus) باستخدام الإحداثيات التالية: Anterior, posterior -2, medial lateral ±1, dorsal ventral -1. ستكون هذه الإحداثيات واقعة بالقرب من حافة النطاق القحفي. انتظر لمدة خمس دقائق حتى تستقر الأنسجة.

احقن 0.7 µL من محلول AV بمعدل 50 nL في الدقيقة. انتظر لمدة 10 دقائق حتى يتم امتصاص الفيروس بالكامل. ثم اسحب الإبرة برفق.

قم بالتنشيف باستخدام رغوة الجل في حال حدوث نزيف. كرر العملية على الجانب المقابل. ضع غطاء الشريحة الزجاجية المعقم والجاف فوق الأم الجافية داخل إطار الدائرة المحفورة.

أمسك بغطاء الشريحة باستخدام الملقط لضغط الأم الجافية برفق وتقريب حواف غطاء الشريحة من سطح الجمجمة. وباستخدام إبرة معقمة، ضع صمغ السيانوأكريليت الكثيف على حواف غطاء الشريحة لتثبيتها بالجمجمة. انتظر حتى يجف الصمغ.

ضع شريط تثبيت، أو صامولة أنتون (anton nut)، أو تصميماً مخصصاً في الجزء الأمامي من الجمجمة. لاحظ أنه يجب وضع شريط التثبيت في موضع يتيح التموضع الأفقي لنافذة الجمجمة أثناء جلسة التصوير. ضع الغراء فوق حواف الشريط.

انتظر حتى يجف الغراء. لاحظ أنه يجب وضع شريط التثبيت في أبعد نقطة ممكنة عن النافذة؛ فإذا وُضع قريباً جداً من النافذة، فقد يشكل الشريط والبرغي الذي يربطه بالحامل المصمم خصيصاً عائقاً أمام العدسة الشيئية أثناء عملية التصوير.

قم بتحضير الأكريليك السني ووضعه على سطح الجمجمة حول الزجاج. ومن المفيد تشكيل شكل يشبه الفوهة حول النافذة، حيث سيعمل ذلك على إنشاء تجويف للمياه التي ستُضاف لاحقاً للتصوير باستخدام العدسة المغمورة في الماء.

قم بتشكيل غطاء باستخدام الأكريليك السني، بحيث يغطي بقية حواف الجلد في المنطقة التشغيلية وشريط التثبيت، مع تعزيز الفوهة المحيطة بالنافذة القحفية. انتظر حتى يتصلب الأسمنت السني، ثم قم بإخراج الحيوان من الإطار التجسيمي ووضعه في غرفة التعافي.

انتظر حتى يتعافى الحيوان من الجراحة مع مراقبة الوظائف الفسيولوجية. قم بتطبيق التخدير بعد الجراحة باستخدام cyroproferrin بجرعة 10 milligrams per kilogram، والعلاج بالمضادات الحيوية باستخدام baytril بجرعة five milligrams per kilogram، لمدة 48 hours. ابدأ بتشغيل ليزر ti sapphire، ثم قم بتشغيل المجهر.

النظام المستخدم في هذه التجربة مجهز بليزر ثنائي الفوتون، ونظام OPO، وأنبوب تضاعف ضوئي (PMT) مزدوج من زرنيخيد الغاليوم. ضع الحيوان في غرفة التحريض وقم بتحريض التخدير. أخرج الحيوان من غرفة التحريض وضعه في قناع التخدير الغازي تحت المجهر.

قم بخفض تدفق الأكسجين إلى 0.3 لتر في الدقيقة وتركيز الإيزوفلوران إلى 1.52%. قم بتثبيت الحيوان في إطار المجهر المخصص باستخدام برغي MT أو نظام مخصص آخر. قم بموازنة النافذة القحفية. ملاحظة: يمكن استخدام نظام تثبيت الرأس الخاص بالشركة المصنعة للمجهر، على الرغم من أن الإطار المخصص يمنح نتائج أفضل، واستقراراً أكبر للرأس، وتحديد موقع ثابت عبر جلسات متعددة خلال التجربة المزمنة.

باستخدام إعدادات المجهر ذي المجال الواسع وعدسة شيئية ذات تكبير منخفض، قم بتوسيط الرؤية على أحد جانبي القشرة خلف الشبكية وتركيزها على سطح غطاء الشريحة. ضع قطرة من الماء في البئر الأكريليكي الذي يشبه الفوهة. انتقل إلى عدسة شيئية غمر مائي ذات مسافة عمل طويلة.

حرك العدسة الشيئية باتجاه النافذة القحفية حتى يتصل السطح الهلالي للماء بين العينة والعدسة الشيئية. انتقل إلى إعدادات التصوير ثنائي الفوتون وابدأ بمسح العينة من الأعلى إلى الأسفل باستخدام أدنى مستوى تكبير. سيظهر تقاطع الأم الجافية على شكل توهج لإشارة عالية غير محددة.

قم بضبط إعدادات الالتقاط في المجهر لكل من قناتي GFP وmCherry وفقًا لقوة الإشارة المنبعثة من الخلايا الفلورية من أجل تغطية النطاق الديناميكي بالكامل. وبعد العثور على عصبون مناسب تكون شجرته التغصنية منفصلة عن الخلايا الأخرى، قم بإجراء مسح أولي باستخدام مرشحات GFP فقط، مع ضبط المجهر على أدنى مستوى تكبير ومسافة Z قدرها 5 microns. استخرج مسقطًا أقصى (maximum projection) لمجموعة المسحات المكدسة وقم بطباعتها لإضافة الملاحظات باستخدام ألوان معكوسة.

اضبط التكبير على قيمة تسمح بتصوير التفاصيل المورفولوجية المطلوبة. قم بتصوير الشجرة التغصنية بأكملها في قناتي GFP وmCherry باستخدام الإسقاط الأقصى كدليل. وباستخدام هذا البروتوكول، سيكون من الممكن مراقبة كل من الهياكل قبل المشبكية وبعد المشبكية في القشرة خلف الوربية بشكل متكرر.

يمكن استخدام هذا النهج في التجارب المزمنة حيث يُتوقع أن ترتبط التلاعبات السلوكية بتغيرات في مورفولوجيا الزوائد الشجيرية، أو الأشواك المشبكية، أو العصبونات قبل المشبكية. يمكن إجراء جلسات التصوير بأي تكرار، ولكن يُفضل وجود فاصل زمني مدته 24 ساعة للسماح للحيوان بالتعافي التام وتقليل تأثير التخدير. وإذا طُبقت هذه التقنية بشكل صحيح، فإنها تتيح إجراء جلسات تصوير متعددة على مدار عدة أشهر.