Radiolabeling والكمي لمستويات الخلايا من Phosphoinositides التي كتبها التلألؤ تدفق عالية الأداء اللوني السائل الديناميكي

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس كمية كل نوع من أنواع الفوسفوينوسيتيد في الخلايا في ظل ظروف وراثية وبيئية مختلفة من أجل فهم وظيفة الفوسفينوزيتيد وتنظيمه. تتحكم دهون الفوسفوينوسيتيد في وظائف الخلية مثل الهجرة والنسخ المتماثل والاتجار بالذاكرة. تحدد هذه الطريقة الظروف الوراثية والبيئية التي تؤثر على الفوسفينوسيتيدات وتزيد من معرفتنا بتنظيمها ووظيفتها.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بقياس دقيق ومتزامن لجميع الفوسفينوسيتيدات داخل الخلايا. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتنظيم الفوسفينوسيتيدات في الخمائر ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على خلايا الثدييات المستزرعة. سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب الخطوات العديدة المطلوبة لوضع العلامات والمعالجة والتحليل.

نوصي بالتدرب بدون الملصق المشع أولا. للبدء ، قم بزراعة مزرعة سائلة 20 مل من سلالة الخميرة SEY6210 ، في وسط اصطناعي كامل عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر إلى مرحلة منتصف السجل. بعد ذلك ، قم بنقل ما مجموعه 10 إلى 14 OD من خلايا الخميرة إلى أنبوب طرد مركزي دائري القاع سعة 12 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 800 مرة G لمدة خمس دقائق.

صب الوسط. وإعادة تعليق الحبيبات في 2 ملليلتر من وسط خالية من الإينوزيتول. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى.

ثم أعد تعليق الحبيبات في 440 ميكرولتر من الوسط الخالي من الإينوزيتول. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، أضف 60 ميكرولتر من التريتيوم المسمى ميو إينوزيتول وقم بزراعة الخلايا لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات إضافية عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز مستمر.

انقل معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 500 ميكرولتر من 9٪ من حمض البيركلوريك و 200 ميكرولتر من الخرز الزجاجي المغسول بالحمض. امزج عن طريق قلب الأنبوب بشكل متكرر ، ثم احتضانه على الثلج لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بدوامة الأنبوب بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق.

ثم انقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد باستخدام طرف تحميل هلام لتجنب شفط الخرز الزجاجي. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب وتخلص من المادة الطافية. قم بتقطيع الحبيبات في مليلتر واحد من الثلج البارد 100 ملليمولار EDTA حتى يتم تشتيتها تماما ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى.

بعد الطرد المركزي ، قم بسحب EDTA من الأنبوب الذي يحتوي على الحبيبات المسماة بالراديو. أضف 50 ميكرولتر من الماء وصوتنة لإعادة تعليق الحبيبات. قم بإعداد كاشف إزالة الأسيل الجديد وفقا لبروتوكول النص.

ثم أضف 500 ميكرولتر من كاشف إزالة الأكواب إلى الأنبوب ، وصوتنة للخلط. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، انقل العينة إلى كتلة تسخين عند 53 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة.

بعد ذلك ، ضع العينة في جهاز طرد مركزي مفرغ واتركها تجف لمدة ثلاث ساعات على الأقل. أعد تعليق الحبيبات عن طريق صوتنة في 300 ميكرولتر من الماء ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، جفف العينة تماما في جهاز طرد مركزي مفرغ لمدة ثلاث ساعات على الأقل.

بعد التجفيف ، أضف 450 ميكرولتر من الماء إلى الأنبوب وأعد تعليق الحبيبات عن طريق صوتنة حتى يتم تشتتها تماما. تحضير كاشف استخراج جديد وفقا لبروتوكول النص. أضف 300 ميكرولتر من كاشف الاستخراج والدوامة بأقصى سرعة لمدة خمس دقائق.

قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 18000 مرة G لمدة دقيقتين ، وقم بسحب الطبقة المائية السفلية بعناية في أنبوب جديد. بعد ذلك ، جفف الجزء المائي النهائي عن طريق الطرد المركزي بالفراغ لمدة ثلاث ساعات على الأقل. بعد ذلك ، قم بتفريق الحبيبات بالكامل عن طريق صوتنة في 50 ميكرولتر من الماء ، وقم بتخزين العينة عند 20 درجة مئوية.

أخيرا ، حدد النشاط الإشعاعي للعينة عن طريق إضافة ميكرولترين إلى أربعة ملليلتر من سائل التلألؤ في قارورة تلألؤ من البولي إيثيلين سعة 6 مل. سجل التكلفة لكل ألف ظهور للقارورة باستخدام عداد تلألؤ سائل بنافذة مفتوحة. لإعداد نظام HPLC لفصل التريتيوم المسمى glycero-inositides ، قم أولا بإعداد المخازن المؤقتة A و B ، وعمود الكروماتوغرافيا وفقا لبروتوكول النص.

بعد ذلك ، قم بتحميل 10 ملايين جزء في المليون من العينة في قارورة حقن سعة ملليلترين ، مزودة بملحق 250 ميكرولتر محمل بنابض ، وأضف الماء لحجم إجمالي يبلغ 55 ميكرولترا. قم بتغطية القارورة بغطاء لولبي مزود بحاجز سيليكون PTFE وضعه في صينية أخذ العينات التلقائية لنظام HPLC ، جنبا إلى جنب مع ماء فارغ في قارورة مماثلة. باستخدام البرنامج الموجود على نظام HPLC ، قم ببرمجة بروتوكول الشطف.

واحد بالمائة مخزن مؤقت B لمدة خمس دقائق ، واحد إلى 20 بالمائة B لمدة أربعين دقيقة ، 20 إلى 100 بالمائة B لمدة عشر دقائق ، 100٪ B لمدة خمس دقائق ، 100 إلى واحد بالمائة B لمدة عشرين دقيقة ، ثم واحد بالمائة B لمدة عشر دقائق. اضبط معدل تدفق المضخة على 1.0 ملليلتر في الدقيقة على مدى 90 دقيقة ، وحد الضغط عند 400 بار. اتبع ذلك عن طريق إعداد بروتوكول كشف على وميض التدفق ليعمل لمدة 60 دقيقة ، مع معدل تدفق سائل التلألؤ 2.5 في الدقيقة ، ووقت مكوث يبلغ 8.57 ثانية.

بعد ذلك ، قم ببرمجة تسلسل حقن آلي على HPLC ليبدأ بالماء الفارغ الذي يقوم بتشغيل بروتوكول التوازن ، متبوعا بالعينة المصنفة بالراديو على بروتوكول الشطف. قبل اكتمال بروتوكول التوازن، قم بإنشاء تسلسل دفعي على وميض التدفق لقياس جميع العينات باستخدام بروتوكول الكشف، الذي يتم تشغيله بواسطة بروتوكول الشطف. لتحليل بيانات HPLC ، افتح أولا ملف البيانات الأولية لكل عينة ، باستخدام برنامج قياس كمية الكروماتوغراف.

في علامة التبويب chromatogram ، قم بالتكبير لتمديد القمم الصغرى مع الحفاظ على دقة الوقت. استخدم أداة إضافة عائد استثمار لتمييز كل ذروة للتحليل ، ثم حدد القمم بناء على وقت شطفها. استخدم علامة تبويب جدول المناطق لتحديد موقع منطقة كل ذروة وتسجيلها.

في الوقت نفسه ، لاحظ وقت البدء والانتهاء لكل ذروة. بعد ذلك ، قم بإجراء طرح في الخلفية لكل ذروة عن طريق تمييز منطقة مجاورة للقمة ، تمتد على نفس القدر الزمني. باستخدام برنامج جداول البيانات، اطرح عدد الأعداد لتلك المنطقة من أعداد الذروة المقابلة.

تطبيع منطقة كل ذروة ضد الذروة الإينوزيتول الغليسراتي الأبوية, وتسجيل كنسبة مئوية من فوسفاتيديلينوسيتول الوالدين. ثم قم بتطبيع كل قمم في كل حالة تجريبية مقابل حالة التحكم ، وعبر عنها مع زيادة الطية النهائية مقارنة بعنصر التحكم. قم بتصدير الملفات بالنقر فوق ملف ، وحفظ باسم ، واختيار تنسيق CSV.

أخيرا ، افتح ملف CSV في برنامج جداول بيانات لرسم البيانات. تم إجراء تحليل فوسفوينوسيتيدات الخميرة ذات العلامات الراديوية بواسطة HPLC. نظرا لأن خلايا الخميرة تولد أربعة فوسفوينوسيتيدات فقط ، يمكن تحقيق الدقة باستخدام طريقة شطف التدرج المزدوج لمدة ساعة واحدة.

ذروة الإينوزيتول الغليسريتد في التلميح في ثماني إلى تسع دقائق طغت على الإشارة من جميع الأنواع الفسفرة الأخرى. لذلك ، من الضروري تكبير جزء التتبع الذي يحتوي على القمم الأخرى قبل دمج الإشارات المشعة. تم فحص سلالات الخميرة المحذوفة من النوع البري و ATG18 المحذوفة و VAC14 للتغييرات في الفوسفاتيديلينوسيتول 3 و 5-ثنائي الفوسفات باستخدام طريقة HPLC هذه.

تبين أن الطفرة المحذوفة ATG18 تنتج معظم الفوسفاتيديلينوسيتول 3 و 5-ثنائي الفوسفات وأنتج الطفرة المحذوفة VAC14 أقل. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أربعة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحسين ظروف النمو ووضع العلامات بناء على سلالة الخميرة أو أنواع الخلايا المحددة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق أخرى ، مثل أجهزة الاستشعار الحيوية المنصهرة ب GFP ، لاستكمال تلألؤ تدفق HPLC للكشف عن الفوسفينوزيتيدات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية الفوسفينوسيتيدات واستخراجها وقياسها بواسطة تلألؤ التدفق المقترن ب HPLC. لا تنس أن العمل مع النشاط الإشعاعي والمذيبات العضوية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية والتدريب المناسب أثناء تنفيذ هذا الإجراء.