النسخ في والسلوكية الفحص لMechanosensation من MARCM المستندة ذبابة الفاكهة السوداء البطن

الهدف العام من هذا الإجراء هو اختبار الطفرات التي تؤثر على الإحساس بالمينو في الذباب البالغ. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد الأسئلة الرئيسية في مجال الإحساس بالمينو ، مثل تحديد قناة Meno الحساسة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه باستخدام الفسيفساء ، يمكننا فحص الطفرات التي قد تكون قاتلة للكائن الحي.

باستخدام شاشة الفسيفساء ، يمكننا تحديد الطفرات التي ربما فاتتها الشاشات السلوكية التقليدية. العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية. يصعب تعلم خطوات الاختبار السلوكي.

يتطلب الأمر يدا ثابتة وممارسة لتحديد الشعيرات ذات الصلة. لبدء التجربة ، احتفظ بالذباب على وسائط دبس دقيق الذرة وقم بتخزينها في حاضنة. احصل على إناث عذراء من مخزون جاهز يحتوي على العناصر الوراثية الضرورية.

اعبر الإناث البكر الجاهزة للماركوم إلى الذكور التي تحتوي على طفرة الاهتمام وموقع FRT المقابل لها. بعد ذلك ، قم بإعداد صليب التحكم الثاني باستخدام ذكور الذباب التي تحتوي على نفس موقع FRT ، ولكن بدون طفرة. بنسبة خمس إناث إلى ذكر واحد ، بعد السماح للذباب بالتزاوج لمدة ليلة واحدة على الأقل ، انقل البالغين إلى قوارير جديدة ذات وسائط جديدة.

دع الذباب يضع بيضه في درجة حرارة الغرفة في خزانة مظلمة. بمجرد أن يضع الذباب البيض ، انقل الصلبان إلى قوارير جديدة. وثق أوقات بدء وانتهاء فترة وضع البيض.

احتفظ بالقوارير التي تنتج أكثر من 20 بيضة للصدمة الحرارية وأعدها إلى الحاضنة. بعد 85 إلى 100 ساعة من وضع البيض ، ضع القوارير في حمام مائي ، تأكد من أن مستوى الماء أعلى من ارتفاع الوسائط ، لكنه لا يغمر القوارير بالكامل. بعد ساعة واحدة ، أخرج القوارير من الحمام المائي ووفر للذباب فترة نقاهة.

بعد التعافي ، ضع القوارير مرة أخرى في الحمام المائي لمدة ساعة. أخرج القوارير من الحمام المائي واحفظها مرة أخرى في الحاضنة بعد التخدير. الذباب على الجليد.

بمجرد أن يصبح الذباب غير متحرك ، حدد الأفراد الذين يحتوون على جميع السمات المرغوبة. بعد ذلك ، قم بقطع رأس الذباب المحدد بعناية باستخدام مقص استئصال القزحية مع الحرص على وضع المقص بين الرأس والصدر. قطع الاتصال دون قطع الصدر.

ضع الذباب مقطوع الرأس في بيئة مغلقة ورطبة واتركه يتعافى لمدة 10 إلى 20 ساعة عند الشفاء. استرجع الذباب للفحص. استخدم فقط الذباب الذي يكتب نفسه.

عندما تشعر بالانزعاج ، راقب الذباب المقطوع الرأس تحت مجهر تشريح مضان لتحديد المستنسخة متماثلة اللواقح المميزة ب GFP. في الأعضاء الحسية الخارجية ذات الشعر الخشن. سجل اسم الشعر الخشن وما إذا كان على الجانب الأيسر أو الأيمن من الذبابة ، واجعل رد فعل الحلاقة عن طريق تحويل الشعيرات المميزة GFP نحو جسم الذبابة بشعر صلب أو ملقط ناعم ولاحظ استجابة الساق.

درجة الجيوب الأنفية من واحد للذباب الذي يرفع ساقه استجابة لتحفيز الشعر الخشن ودرجة الجيوب الأنفية صفر للذباب الذي لا يحرك أرجله. عندما يكون ذلك ممكنا. نقوم باختبار الذباب الذي يحتوي على نسيج فسيفسائي على شعيرات ما بعد AOR ، والتي تستجيب جيدا للتحفيز باستخدام الفحص السلوكي في شعيرات ما بعد AOR ، بينما تمت مقارنة الذباب من النوع مع الطفرة الحساسة للميكانيكا المعروفة ، ولم يعطل أي مستقبل ميكانيكي محتمل C أو NMSI ، واستجاب الذباب للتحكم في استجابة الاستمالة ل 34٪ من تحفيزات الشعر الخشن.

في المقابل ، أظهرت ذات الشعيرات المتماثلة اللواقح ل NMSI استجابة بنسبة 2٪. بعد هذا الإجراء وتحديد جين استجابة سلوكي جديد ، يمكن استخدام تجارب إضافية مثل الفيزيولوجيا الكهربية وتوطين البروتين. لتوصيف دور هذا الجين بشكل أكبر ، على سبيل المثال ، يمكننا الإجابة على السؤال عما إذا كان الجين متورطا في نقل الإحساس بالمينو أو تطور الخلايا العصبية الحسية للانقطاع الطمثي.