تقييم مستو خلية-التقاطب الظواهر في Ciliopathy ماوس المسخ القوقعة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو فحص قوقعة الفأر الهدبي الطافرة بحثا عن الأنماط الظاهرية للخلية المستوية. تسمح هذه التقنيات بتفصيل شامل للنمط الظاهري للقوقعة الصناعية ، مما سيؤدي إلى فهم أكثر دقة للمشاركة الهدبية في إنشاء إشارات PCP للفقاريات. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه بمجرد إتقانه ، يمكن استخدام ظهارة القوقعة الصناعية التي تم تشريحها لمجموعة متنوعة من الأنواع المختلفة من تحليل النمط الظاهري.

بعد تحضير الكواشف والأنسجة من التجارب ، في مرحلة النمو E16.5 إلى p3 ، استخدم شفرة مشرط أو مقصا صغيرا لتشريح الرأس على طول خط الوسط السهمي بدءا من الأنف ويمتد الفلقة. قم بإزالة الدماغ من كل نصف من الجمجمة باستخدام ملقط. بعد ذلك ، حدد العظام الصدغية التي تحتوي على المتاهات العظمية النامية للأذن الداخلية.

أثناء العمل مع العينة تحت مجهر التشريح ، استخدم زوجا من الملقط لتقدير المتاهات العظمية بعيدا عن الجمجمة عن طريق تشغيل الملقط برفق تحت المتاهات العظمية. بعد التشريح ، استخدم طرف ملقط التشريح لتنظيف النوافذ البيضاوية والمستديرة وعمل ثقب صغير في قمة لولب القوقعة. بعد ذلك ، قم بإصلاح المتاهات العظمية في 1.5 مل من 4٪ بارافورمالدهيد لمدة خمس دقائق على الجليد للسماح بإزالة الغشاء الصدري بسهولة.

الآن ، ضع المتاهات العظمية في طبق تشريح مطلي بالسيليكون الأسود يحتوي على PBS لتسهيل التشريح. استخدم الملقط رقم خمسة لإزالة الغضروف الخارجي ، وتعريض قناة القوقعة. ابدأ من النافذة البيضاوية ، وأدخل الطرف السفلي من الملقط في النافذة البيضاوية ، وافتح الغضروف برفق ، وتحرك ببطء لأعلى نحو القمة.

بعد ذلك ، استخدم زوجا ناعما من الملقط لقرص غشاء Reissner في قاعدة قناة القوقعة الصناعية ، وتقشيره بحركة تصاعدية. تصور الجانب الظهري للقناة القوقعية ، بما في ذلك الظهارة الحسية. بعد ذلك ، استخدم الملقط رقم 55 لقرص الغشاء الصدري عند قاعدة القوقعة ، وتقشيره لأعلى باتجاه القمة.

مطلوب الإزالة الكاملة للغشاء الصدري للحصول على أفضل الصور باستخدام الكيمياء المناعية ، وهو ضروري لمسح المجهر الإلكتروني. بعد تعريض عضو كورتي ، قم بإصلاح الأنسجة بشكل أكبر وإجراء الكيمياء المناعية ، أو الاستعداد للفحص المجهري الإلكتروني ، كما هو مفصل في الجزء المكتوب من البروتوكول. بعد تلطيخ الأنسجة ، ضع العينة في طبق مطاط من السيليكون الأسود ، يحتوي على PBS.

باستخدام ملقط دقيق، قم بإزالة المنطقة الدهليزية من دوامة القوقعة الصناعية. بعد ذلك ، قم بإزالة الغضروف الأساسي واللحمة المتوسطة بعناية فائقة من دوامة القوقعة الصناعية. يحتوي الحلزون القوقعي المتبقي على التلم الداخلي وعضو الكورتي والتلم الخارجي.

انقل دوامة القوقعة الصناعية إلى قطرة من PBS موضوعة على شريحة مجهرية. قم بإزالة PBS بمنديل ماص أو قطعة من ورق الترشيح ، وأعد وضع لولب القوقعة برفق إذا تحولت الظهارة وتداخلت على نفسها. أضف قطرة من وسائط التثبيت مباشرة على عينة القوقعة ، وضع زلة غطاء برفق مباشرة على العينة ، مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء.

استخدم مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي أو الليزر المزود بتكبير عالي وأهداف فتحة عددية عالية، لالتقاط صور للسطح القمي لخلية شعر القوقعة الصناعية. استخدم أهدافا أقل لالتقاط صور متداخلة لدوامة القوقعة الصناعية لتحديد طول قناة القوقعة الصناعية. تظهر الصور التالية تلطيخا مناعيا فلورية للدوران القاعدي ، وقوقعة من النوع الأول بعد الولادة.

يصنف الفالودين الأكتين الخيطي في الأهداب المجسمة ، والأكتين القشري في محيط الخلية. الميوسين السابع هو علامة لخلايا الشعر الداخلية والخارجية. يقوم ZO_1 بتسمية التقاطعات الضيقة بين الخلايا ، مما يجعلها علامة رائعة لتمييز حدود الخلية.

يستخدم ألفا توبولين الأسيتيل كعلامة للكينوسيليوم عند رأس الحزمة ، كما هو موضح في السهم الأبيض. يتم أيضا تمييز الأنابيب الدقيقة الداخلية بواسطة ألفا توبولين الأسيتيل ، والتي تكون وفيرة بشكل خاص في الخلايا العمودية ، كما يتضح من العلامات النجمية البيضاء. توضح هذه الصورة لقنوات القوقعة الصناعية المقطعة في E18.5 ، الملطخة بالأنابيب الأسيتيل ، تقصيرا ملحوظا لقنوات القوقعة الصناعية المشروطة IFT20 مقارنة بالسيطرة.

الصورة التالية عبارة عن تحضير كامل للدوران القاعدي للقوقعة القاعدية ، في فئران بالضربة القاضية BBS8 ، في يوم ما بعد الولادة صفر. يتم تدوير الحزم التجسيمية في قوقعة BBS8 بالضربة القاضية بشكل متغير ، كما هو موضح بالسهم الأيمن ، أو تسويته ووضعه بشكل خاطئ ، كما هو موضح في السهم الأوسط. يتم تحديد موقع kinocilia بشكل خاطئ ، أو أن المحاور مفقودة ، كما هو موضح في السهم الأيسر.

عند تحضير النمط الظاهري للقوقعة الصناعية للتحليل، من المهم أن تتذكر أن الاختلافات في الخلفية الجينية يمكن أن تعدل النمط الظاهري للقوقعة. لذلك ، من المهم استخدام عناصر تحكم littermate للتحليل. تشمل التحليلات الإضافية اختبار قياس السمع واستزراع نباتات القوقعة الصناعية ، مما يسمح بالعلاج بالعديد من منشطات أو مثبطات الإشارات ، مما يساهم في الفهم الميكانيكي للعمليات التنموية المعنية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير أنسجة القوقعة الصناعية لتحليل دور المكونات الهدبية وتأثيراتها المميزة على إشارات PCP.