جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

نقدم طريقة لعزل الجهاز الكبار كورتي كما ثلاث لفات سليمة قوقعة (قمة، والمتوسطة، وقاعدة). علينا أيضا أن يبرهن على وجود إجراءات المناعية مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently. معا هذه التقنيات تتيح دراسة خلايا الشعر والخلايا الداعمة، وأنواع الخلايا الأخرى الموجودة في القوقعة.

الهدف العام من طريقة تشريح التثبيت بأكملها هو عزل المنطقة الحسية للقوقعة البالغة المتكلسة كثلاثة لفات سليمة: القمة والوسط والقاعدة. تحافظ طريقة التشريح هذه على البنية ثلاثية الأبعاد لعضو كورتي ، وتسمح بتصور جميع الخلايا عند دمجها مع التلوين المناعي والفحص المجهري متحد البؤر للتصوير على مستويات مختلفة في المحور Z. مقارنة بطرق التشريح السابقة ، نستخدم استراتيجية مختلفة تولد ثلاث لفات قوقعة صناعية أكبر وأقل عرضة للضياع أو التلف في عملية التلوين المناعي.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم التشريح. نظرا لأن عضو كورتي هش ، فهناك هامش صغير للخطأ عند إزالة الرباط الحلزوني. بعد القتل الرحيم للحيوان وفقا للإجراءات المعتمدة وإزالة الدماغ ، ابدأ بتحديد العظام الصدغية في قاعدة جمجمة الفأر.

ثم اكشط الأعصاب القحفية باستخدام ملقط نمط قياسي. ضع الملقط عند طرف الكبسولة الأذنية واستخدم إبهام اليد المعاكسة للضغط لأسفل على القناة الخلفية شبه الدائرية لإخراج القوقعة المغلفة. حرر النصف السفلي من العظم الصدغي من الجمجمة إما يدويا بإصبع الإبهام والسبابة أو باستخدام مقص دقيق 10.5 سم ، وضعه في الفحص المجهري الإلكتروني الخالي من الميثانول بدرجة 4٪ بارافورمالدهيد لإصلاحه.

بعد التثبيت ، قم بإزالة الكلس من العظام الصدغية وفقا للتعليمات الواردة في الجزء المكتوب من البروتوكول. لتحديد ما إذا كانت العينة منزعة الكلس بشكل كاف ، ضع العظام الصدغية على طبق تشريح مطلي بالسيليكون المطاط الصناعي ، واضغط برفق على القوقعة على شكل حلزون. إذا كانت الأنسجة إسفنجية ، فإن إزالة الكلس تكتمل.

أضف PBS إلى طبق التشريح ، ثم أثناء العمل تحت مجهر تشريح استريو ، استخدم الملقط رقم أربعة أو خمسة لتثبيت العظم الصدغي في المنطقة الدهليزية ومقص زنبركي Vannas-Tubingen بسعة خمسة ملليلتر لقطع أنسجة الكبسولة الأذنية الزائدة على طول الجانبين وفوق القمة. باستخدام مقص زنبركي Vannas سعة 2.5 مل ، أدخل شفرة واحدة في النافذة البيضاوية وقم بعمل عدة قطع صغيرة على طول الرباط الحلزوني للدوران القاعدي. الآن ، أدخل شفرة واحدة من مقص زنبركي Vannas-Tubingen سعة خمسة ملليلتر في المنطقة المقطوعة للتو ، وضع الشفرة الأخرى على السطح الخارجي للعظم الصدغي ، وسطي للنافذة البيضاوية.

يفصل هذا القطع المنعطف القاعدي عن المنعطفات الوسطى والقمي. بعد ذلك ، لإكمال تشريح المنعطف القاعدي ، استخدم مقص زنبركي سعة 2.5 مليلتر لقطع الألياف العصبية العقدية الحلزونية التي تتصل ب modiolus لتحرير التوتر في المنعطف القاعدي. قطع أسفل المنعطف القاعدي للفصل عن الأعضاء الدهليزية.

استخدم الملقط لتوجيه الأنسجة وتثبيت ألياف العقدة الحلزونية في الطبق المغطى بالسيليكون المطاط الصناعي. قم بعمل سلسلة من الجروح الصغيرة لإزالة الرباط الحلزوني من أعلى وأسفل عضو كورتي. مع تثبيت ألياف العقدة الحلزونية على الطبق المطلي بالسيليكون المطاط الصناعي ، استخدم الملقط لإزالة أي غشاء ريسنر متبقي من عضو كورتي.

قم بإجراء عدة تخفيضات لتقليل سمك محاور العقدة الحلزونية. ثم أمسك المحاور المتبقية من العقدة الحلزونية بالملقط وانقل المنعطف القاعدي المفصل إلى صفيحة 48 بئر تحتوي على ما يقرب من 500 ميكرولتر من PBS. الآن افصل بين المنعطفات الوسطى والقمية عن طريق وضع الثلثين المتبقيين من الجانب القمي للقوقعة لأسفل.

ثم أدخل شفرة واحدة من مقص 2.5 مليلتر في وسائط سكالا ، حيث كان المنعطف الأوسط متصلا مسبقا بالدوران القاعدي ، وقم بإجراء عدة قطع على طول الرباط الحلزوني للمنعطف الأوسط. باستخدام مقص سعة خمسة ملليلتر ، أدخل شفرة واحدة في منطقة القطع ، مع وضع المنعطف الأوسط أعلى الشفرة. ضع الشفرة الأخرى على السطح الخارجي للمتاهة العظمية بزاوية 90 درجة من الطرف القمي.

هذا القطع يفصل المنعطف الأوسط عن المنعطف القمي. بعد ذلك ، أكمل تشريح المنعطف الأوسط عن طريق إزالة الرباط الحلزوني من عضو كورتي. انقل المنعطف المفصل إلى طبق 48 بئر ، كما كان من قبل.

الآن ، استخدم مقص زنبركي Vannas سعة 2.5 مل لفتح الغطاء الذي يغطي المنعطف القمي ، وكرر الإجراء لإزالة الرباط الحلزوني القمي من عضو كورتي. انقل المنعطف المفصل إلى طبق 48 بئر ، كما كان من قبل. لبدء إجراء التلوين المناعي ، قم أولا بشفط PBS من كل بئر ، ثم استبدلها ب 200 إلى 300 ميكرولتر من محلول الحجب واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على محور دوار ثلاثي الأبعاد.

بمجرد انقضاء وقت الحضانة ، قم بإزالة محلول الحجب واستبدله ب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي ، المخفف بشكل مناسب في محلول الناقل. احتضان بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية على دوار ثلاثي الأبعاد. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي وغسل كل بئر ب 500 ميكرولتر من PBS لمدة خمس دقائق على الأقل في كل مرة ، في درجة حرارة الغرفة.

كرر الغسيل مرتين. بعد الغسيل الأخير ، قم بشفط PBS واحرص على عدم امتصاص المنعطف المقطوع في طرف الماصة. استبدل ب 100 ميكرولتر لكل بئر من الجسم المضاد الثانوي الموسوم بالفلورسنت المخفف في محلول الناقل.

ضع لوحة 48 جيدا في صندوق أسود للحماية من الضوء ، وضعها على الدوار ثلاثي الأبعاد للاحتضان لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، استنشق محلول الأجسام المضادة الثانوية واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS كما كان من قبل. بعد إزالة الغسيل الأخير ، أضف 100 ميكرولتر من Hoechst لتسمية النوى.

احميها من الضوء واحتضانها لمدة 15 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على محور دوار ثلاثي الأبعاد. أخيرا ، قم بإزالة محلول Hoechst واغسله ثلاث مرات باستخدام PBS كما كان من قبل. بعد وضع العلامات على كل شريحة ، ضع الماصة 50 ميكرولترا من وسائط التثبيت على كل شريحة.

ثم باستخدام ملقط الصائغ المستقيم رقم أربعة أو الخامسة ، أمسك محاور العقدة الحلزونية وانقل منعطفا واحدا للقوقعة الصناعية برفق من لوحة البئر 48 إلى وسائط التثبيت. استخدم المجهر للتأكد من أن المنعطف المقطوع ليس مطويا أو ملتويا. ضع أحد طرفي زلة الغطاء على شريحة ، ثم حرره برفق للسماح للغطاء بالانزلاق.

استخدم مجهر تشريح استريو للتأكد من أن دوران القوقعة الصناعية ليس بالقرب من فقاعة هواء. في حالة حدوث ذلك، حرك زلة الغطاء برفق ذهابا وإيابا لإعادة وضع منعطف القوقعة الصناعية. كرر الإجراء لمنعطفات القوقعة الأخرى.

قم بتركيب لفة واحدة من القوقعة الصناعية لكل شريحة لمنع التعرض للضوء وتبييض الصور أثناء عملية التصوير. ضع الشرائح في مجلد شرائح بحيث تكون مسطحة. احم من الضوء واترك وسائط التركيب تتجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

في اليوم التالي ، ينزلق غطاء الختم بطلاء أظافر شفاف ، ويخزن في درجة حرارة الغرفة أو 20 درجة مئوية حتى يتم تصويره. تظهر صورة الشريحة متحدة البؤر هذه المنعطف الأوسط للقوقعة المعزولة عن فأر p15. تم تراكب صور 420X لإعادة بناء المنعطف الأوسط بالكامل.

خلايا الشعر ، المصنفة بجسم مضاد أولي مضاد للميوسين VIIa للأرانب وجسم مضاد ثانوي مترافق Alexa 647 أرجوانيا. تظهر الخلايا الداعمة ، المسماة بجسم مضاد أولي مضاد ل SOX2 للماعز وجسم مضاد ثانوي مترافق Alexa 568 باللون الأخضر. تظهر النوى باللون الأزرق بسبب صبغة Hoechst.

يمثل شريط المقياس 100 ميكرون. تظهر هذه الصورة مقطعا عرضيا بصريا للمنعطف الأوسط معزولا عن فأر عمره ستة أسابيع في المستوى X ، Z. مرة أخرى ، يتم تصنيف خلايا الشعر بفلوروفور أرجواني والخلايا الداعمة بفلوروفور يظهر باللون الأخضر.

هذا تكبير متزايد للصورة السابقة ، مع إزالة الشعيرات المتصالبة. يمثل شريط المقياس 20 ميكرون. توضح الصور الأربع التالية بعض المشكلات التي يمكن أن تحدث أثناء تشريح الحامل بالكامل، أو عند تشغيل القوقعة الصناعية على الشرائح.

هنا ، على الجانب الأيسر من الصورة ، تم قطع أنسجة القوقعة الصناعية بجوار الصف الأخير من خلايا الشعر الخارجية ، مما تسبب في تركيب العديد من هذه الخلايا بزوايا مختلفة. في هذه الصورة ، تم قطع جزء من عضو كورتي على الجانب الأيسر. يوجد ثقب مثقوب في منطقة خلية الشعر الخارجية في منتصف الصورة.

هنا يتم طي عضو كورتي في عدة أماكن. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال تقنية تشريح التثبيت بالكامل في غضون 20 إلى 30 دقيقة. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم تجنب وضع الملقط على عضو كورتي وتجنب شد الرباط الحلزوني أو الإمساك به.

بدلا من ذلك ، أغلق الملقط وقم بتثبيت ألياف العقدة الحلزونية في الطبق المطلي بالسيليكون المطاط الصناعي. تعتبر العينات من الفئران التي يبلغ عمرها أسبوعا إلى ثلاثة أسابيع أكثر تسامحا ومفيدة لتعلم طريقة التشريح. بالإضافة إلى ذلك ، يصعب تشريح العينات المصابة بتلف خلايا الشعر ، مع وجود أنسجة مكشوفة للضوضاء صعبة وهشة بشكل خاص.

باتباع إجراء التشريح هذا ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل الفحص المجهري الإلكتروني المسح. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مثبت مختلف. بالإضافة إلى ذلك، أجرينا تعديلات طفيفة على هذا البروتوكول لتشريح أنسجة قوقعة الأذن للفئران، وفي المستقبل، نأمل في إجراء المزيد من التعديلات لتشريح القوقعة من شينشيلا والجربوع وخنزير غينيا.