الثقافات توليد الخلايا الليفية الأولية من ماوس الأذن والذيل الأنسجة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إنشاء مستنبتات أولية من الخلايا الليفية (fibroblast) من أذني وذيل الفئران. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا الخلية، مثل الفرق بين الخلايا السليمة والخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لهذه الدراسة هي قدرتنا على إنتاج خلايا ليفية من آذان تم تخزينها في وسط غذائي في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 10 أيام قبل عزل الخلايا.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول بيولوجيا الفئران، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على كائنات ثديية أخرى مثل الجرذان والأرانب. قبل جمع الأنسجة، املأ أطباق زراعة قطرها 10 centimeter بـ 10 milliliters من الوسط الغذائي الكامل. ثم، بعد القتل الرحيم للفأر، ابدأ باستخدام أدوات معقمة لجمع عينات الأنسجة.

اجمع أنسجة من الأذن بنصف قطر يبلغ حوالي سنتيمتر واحد، واجمع حوالي خمسة سنتيمترات من أنسجة الذيل. انقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 40 milliliters من الإيثانول بتركيز 70%. اتركها تنقع لمدة خمس دقائق، ثم جففها في الهواء في طبق زراعة مفتوح بقطر 10 centimeter لمدة خمس دقائق داخل غطاء زراعة معقم.

بعد جفاف الأنسجة، انقلها إلى الطبق المحمل بالوسط الغذائي. الآن، قم بقص الشعر من جميع الأنسجة باستخدام المقص، ثم قطع الأنسجة إلى قطع أصغر من 3 mm. انقل الأنسجة المقطعة إلى أنابيب cryotube، ثم املأ الأنابيب بمحلول collagenase D pronase حتى علامة 1.8 mL.

الآن قم بحضن الأنسجة عند 37 درجة Celsius، مع الرج بسرعة 200 rpm لمدة 90 دقيقة. وعند غطاء التدفق الصفحي، املأ طبقاً بـ 10 milliliters من الوسط الكامل. ضع مصفاة خلايا بمسامية 70 micron فوق الطبق، وبعد انتهاء فترة الحضن، صب ناتج هضم الأنسجة في المصفاة.

الآن، قم بطحن الأنسجة في المصفاة باستخدام مكبس. استمر في ذلك لمدة خمس دقائق على الأقل. قم بهز المصفاة من حين لآخر داخل الوسط لغسل الخلايا المنفصلة.

من المهم طحن أنسجة الأذن والذيل المهضومة جيداً من أجل استخلاص عدد جيد من الخلايا. كما يجب التأكد من رج مصفاة الخلايا بعد طحن الأنسجة؛ حيث سيؤدي ذلك إلى غسل خلايا إضافية من المصفاة.

بعد ذلك، اجمع معلق الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. ثم اشطف المصفاة باستخدام 10 milliliters من الوسط، وأضف محلول الشطف إلى المجموعة التي تم جمعها. الآن، قم بغسل الخلايا.

أولاً، يتم تدوير الخلايا لترسيبها باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد. ثانياً، يتم إزالة السائل الطافي. وثالثاً، تُعلق الخلايا في 10 milliliters من الوسط الغذائي الكامل.

كرر عملية الغسل مرة أخرى، وأنهِ الإجراء بوضع الخلايا في وسط غذائي كامل، لتصبح جاهزة للزراعة. لزراعة الخلايا، انقل أولاً معلقات الخلايا إلى أطباق زراعة سعة 10 milliliter. بعد ذلك، أضف 10 microliters من محلول amphrotericin B إلى كل مستنبت.

الآن، قم بتحضين الخلايا لمدة ثلاثة أيام. وفي اليوم الثالث، استبدل الوسط بوسط كامل طازج يحتوي على amphrotericin B. وبعد فترة وجيزة، ستصل المزارع إلى 70% من درجة الالتحام. عند هذه النقطة، قم بإزالة الوسط واشطف المزرعة بخمسة milliliters من 1X PBS.

بعد ذلك، استبدل محلول PBS بملليلترين من محلول 1X trypsin EDTA، واترك الخلايا في الحضانة لمدة خمس دقائق. وبعد انتهاء فترة الحضانة القصيرة، انقر برفق على الأطباق وأضف ستة ملليلترات من الوسط الكامل الطازج إلى كل طبق. الآن، انقل الخلايا المتحررة من الطبق باستخدام الماصة إلى أنبوبين مخروطيين سعة 15 ملليلتر.

بعد ذلك، يتم تدوير الأنابيب لمدة خمس دقائق عند 450 Gs في جهاز طرد مركزي مبرد. أعد تعليق الرواسب في خمسة ملليلتر من الوسط الكامل وقم بقياس كثافة الخلايا في المعلقات. الآن، يتم توزيع الخلايا على أطباق بقطر 10 سنتيمتر بمعدل 200,000 خلية لكل طبق.

يتم تحضين هذه الخلايا لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام حتى تصل إلى درجة تلاقي بنسبة 70%، ثم تكرر عملية جمع الخلايا وإعادة زرعها بكثافة محددة. ويمكن تنميتها بهذه الطريقة لمدة تصل إلى 25 يوماً. وبعد ثلاثة أيام من استخلاص الخلايا، لوحظ وجود حطام خلوي كبير في المزرعة قبل استبدال الوسط الزرعي.

تم تحديد حطام الخلايا بأسهم بيضاء. يمثل شريط القياس 100 microns. أدى الوسط الجديد إلى تقليل حطام الخلايا بشكل ملحوظ.

أظهرت المزارع التي يبلغ عمرها ثلاثة أيام، والمستمدة من أنسجة حُفظت في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 أيام، أن الخلايا الليفية تتمتع بصلابة جيدة. ومن هذه الأنسجة، تم تحقيق درجة تلاقي للخلايا الليفية تتراوح بين 70 إلى 80% بعد خمسة إلى ستة أيام. وقد وُسمت الخلايا بعلامة للخلايا الليفية، وهي vimentin، والتي تظهر باللون الأحمر.

استُخدم DAPI لوسم النوى، والتي تظهر باللون الأزرق. يمثل شريط المقياس 10 microns. ويشير التلوين الموحد إلى أن مزرعة الخلايا الليفية نقية.

لقد حقق البروتوكول الموصوف هذه النتيجة بشكل روتيني. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قد توصلت إلى هذه النتيجة النهائية حول كيفية إنشاء مستنبتات أولية من الخلايا الليفية بسرعة وموثوقية. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، يجب إيلاء اهتمام إضافي أثناء استخراج الخلايا الليفية من الأنسجة، حيث سيؤدي عدم طحن النسيج بشكل كافٍ إلى انخفاض أعداد الخلايا.