التصوير غشاء المحتملة مع اثنين من أنواع مشفرة وراثيا نيون الجهد مجسات

الهدف العام من هذا الإجراء هو الرصد البصري للتغيرات في جهد الغشاء باستخدام مؤشر جهد مشفر جينياً. ستصف هذه الطريقة نقاط القوة والضعف في التصوير باستخدام مجسات فلورية مختلفة للجهد مشفرة جينياً. فعلى سبيل المثال، ستوفر المجسات القائمة على تقنية FRET ميزة التصوير النسبي (ratiometric imaging)، ولكنها ستعطي إشارة أقل.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتنا على تصور النشاط العصبي في الوقت الفعلي. وبشكل عام، سيواجه الأفراد المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن نسبة الإشارة إلى الضوضاء ليست كبيرة جدًا، وهناك عدة مصادر للضوضاء وخطوات متعددة يمكن أن يحدث فيها خطأ. وغالبًا ما يشعر المستخدمون الجدد بالارتباك ويتم اعتبار التداخلات على أنها إشارات حقيقية.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية للتأكد من صحة المجسات المستخدمة وما تشير إليه فعلياً. وبالنسبة للإعداد، يتم تركيب مقسم صور بين كاميرات CCD البطيئة والسريعة لتصوير GEVI القائم على تقنية FRET. وقبل بدء التجربة، يتم إدخال مكعب ترشيح يحتوي على مرآة ثنائية اللون ومرشحي انبعاث في مقسم الصور.

قم بإزالة مكعب المرشح الثاني هذا عند تصوير GEVI يحتوي على بروتين فلوري واحد. لبدء التجربة، حدد خلية HEK293 سليمة تظهر فلورة غشائية موضعية قوية مقارنة بالفلورة الداخلية، وتجنب تثبيت الخلايا الدائرية لأنها إما في طور الانقسام أو تحتضر. ثم قم بتطبيق نبضة اختبار للتحقق من استجابة التيار.

بعد ذلك، خفض ماصة تثبيت الرقعة (patch clamp pipette) لتصبح فوق سطح الخلية مباشرةً. ثم خفض الماصة ببطء حتى تلامس غشاء الخلية برفق. يجب أن تزداد مقاومة الغشاء لتصل إلى 1-2 megaohm.

بعد ذلك، قم بتكوين ختم جيجا-أوم (gigaohm seal) عن طريق تطبيق ضغط سلبي برفق عبر الماصة. وبمجرد تحقيق ختم جيجا-أوم، اضبط جهد الماصة عند جهد التثبيت المطلوب. بعد ذلك، قم بتركيز كاميرا CCD عالية السرعة على جسم الخلية.

لتسجيل GEVI القائم على تقنية FRET، اضبط حجم الصور المقسمة للحصول على عرض متساوٍ لكل طول موجي للانبعاث باستخدام المقابض الموجودة على مقسم الصور. بعد ذلك، قم بتمزيق غشاء الخلية عن طريق تطبيق ضغط سلبي لتشكيل تكوين الخلية الكاملة. الآن، افتح برنامج التصوير.

بعد ذلك، انقر على قائمة acquire SciMeasure camera لفتح صفحة CCD acquire. ثم قم بإنشاء ملف بيانات جديد لحفظ التسجيل. انقر على analog output ثم read an ASCII لفتح ملف بروتوكول النبض من أجل إجراء التصوير.

انقر بعد ذلك على متوسط التكرارات الداخلية لحساب متوسط عدد المحاولات. ثم أغلق صفحة المخرج التماثلي (analogue output). قم بضبط معاملات الاستحواذ المحددة في صفحة الاستحواذ عبر CCD.

بعد ذلك، أدخل القيم المحددة لعدد الإطارات المخصصة للاستحواذ وعدد التجارب. ثم انقر فوق زر "take data optics plus BNC" لبدء التسجيل. وأثناء عملية التصوير الجهدي، راقب راسم الإشارة (oscilloscope) لضمان استقرار تكوين الخلية الكاملة طوال فترة التسجيل.

لحساب التغير الكسري في الفلورة، انقر على file ثم read data file لفتح ملف بيانات تم تسجيله في الخطوة السابقة. يجب أن تظهر صورة الخلية في شدة إضاءتها وقت الراحة على الجانب الأيمن. بعد ذلك، انقر على show BNC's لإظهار قيم جهد النهاية الحالية.

قم بتغيير وضع الصفحة من إطار RLI إلى طرح الإطارات (frame subtraction) من أجل استخدام وظيفة طرح الإطارات لتحديد البكسلات ذات الإشارات البصرية المستجيبة. بعد ذلك، اختر نقطتين زمنيتين لعملية الطرح وحدد منطقة الخلية التي تظهر إشارات استجابةً للتغير في جهد الغشاء. ثم، حدد البكسلات التي تتطلب التحليل عن طريق سحب أو النقر على كل بكسل.

يجب أن يظهر التمثيل الرسومي لمتوسط شدة الفلورة من البكسلات المختارة على الجانب الأيسر من نافذة البرنامج. قم بقسمة البكسلات المطروحة على شدة الضوء في حالة الراحة من خلال النقر على زر divide by RLI للحصول على قيم التغير الكسري للفلورة. لتصدير البيانات، قم بإزالة رسوم جهد النهاية الحالية عن طريق إلغاء تحديد قائمة show BNC's.

انتقل إلى المخرجات (output)، واحفظ المسارات كـ ASCII معروضة (displayed ASCII) لتصدير مسار الفلورسنت في ملف بتنسيق ASCII من أجل تحليل مطابقة المنحنى. في هذا الإجراء، ارسم رسمًا بيانيًا يوضح تغير الفلورسنت مقابل الجهد عن طريق تمثيل التغيرات الكسرية في الفلورسنت استجابةً للجهد في برنامج لتحليل البيانات. بعد ذلك، قم بمطابقة المنحنى بدالة بولتزمان (Boltzmann function) لتحديد نطاق الجهد للإشارة الضوئية من خلال النقر على التحليل (analysis)، ثم المطابقة (fitting)، ثم المطابقة السينية (sigmoidal fit)، ثم فتح مربع الحوار (open dialog).

أعد رسم التغيرات الكسرية الموحدة في الفلورة استجابةً للجهد باستخدام برنامج تحليل البيانات. ولحساب سرعة الاستجابة البصرية، افتح ملف ASCII وارسم منحنى التغير الكسري في الفلورة مقابل الزمن. ثم انقر على محدد البيانات في برنامج تحليل البيانات، وحدد نقطة زمنية أولى تقابل بداية نبضة جهد متدرجة، ونقطة زمنية ثانية حيث تكون الإشارة البصرية قد وصلت إلى الحالة المستقرة.

قم بمطابقة هذا النطاق مع دالتي اضمحلال أسي أحادي ومزدوج من خلال النقر على التحليل (analysis)، ثم المطابقة (fitting)، ثم المطابقة الأسية (exponential fit)، ثم فتح مربع الحوار (open dialog)، وقم بتحديد المطابقة الأفضل. يوضح هذا الشكل التغير في الفلورة لخلية HEK تعبر عن مؤشر جهد عضوي (GEVI) من نوع Bongwoori القائم على بروتين فلوري واحد. هذا تغير فلوري نموذجي استجابةً لنبضات الجهد المدرجة.

هنا تم تصوير خلية HEK293 باستخدام كاميرا CCD عالية السرعة. تُظهر هذه الصورة شدة الضوء في حالة الراحة لخلية تُعبر عن Bongwoori. وهذه صورة طرح الإطارات التي تشير إلى البكسلات التي لوحظ فيها تغير في الفلورية.

يظهر هنا التسجيل البصري لجهود الفعل المستحثة من عصبونات ورك الحصين الأولية للفئران التي تعبر عن Bongwoori. تم استثارة جهود الفعل تحت وضع تثبيت التيار للخلية بأكملها (whole-cell currents clamp mode). وقد تم اختيار تتبع التغير الكسري في الفلورة من البكسلات المرتبطة بجسم الخلية (soma).

في هذا الشكل، يُظهر تغير الفلورة لخلية HEK تعبر عن GEVI القائم على تقنية FRET الاستجابات لنبضات الجهد المتدرجة بطولين موجيين. تم التسجيل بتردد 1 kHz باستخدام كاميرا CCD عالية السرعة. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر اختبار مستويات الفلورة المتغيرة لأن الإفراط في التعبير عن الفلورة يمكن أن يؤثر على صحة الخلية.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل ترميز الشرائح (slicer codings) للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بنشاط العصبونات في الدوائر المختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير جهد الغشاء باستخدام أنواع مختلفة من المجسات.