التصوير غشاء المحتملة مع اثنين من أنواع مشفرة وراثيا نيون الجهد مجسات

الهدف العام من هذا الإجراء هو الإبلاغ بصريا عن التغيرات المحتملة للغشاء باستخدام مؤشر جهد مشفر وراثيا. ستصف هذه الطريقة نقاط القوة والضعف في التصوير باستخدام مجسات الفلورسنت المشفرة وراثيا المختلفة للجهد. على سبيل المثال ، ستوفر المجسات المستندة إلى FRET ميزة التصوير النسبي ولكنها ستعطي إشارة أقل.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا تصور النشاط العصبي في الوقت الفعلي. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن نسبة الإشارة إلى الضوضاء ليست كبيرة جدا وهناك العديد من مصادر الضوضاء والخطوات المتعددة التي يمكن أن تخطئ. غالبا ما يتم الخلط بين المستخدمين الجدد ويؤخذ التداخل على أنه إشارات حقيقية.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية للتأكد من صحة المجسات المستخدمة وما تشير إليه بالفعل. للإعداد ، يتم تثبيت مقسم الصور بين كاميرات CCD البطيئة والسريعة لتصوير GEVI المستند إلى FRET. قبل التجربة ، أدخل مكعب مرشح مع مرآة ثنائية اللون ومرشحين للانبعاث في مقسم الصورة.

قم بإزالة مكعب المرشح الثاني هذا عند تصوير GEVI ببروتين فلوري واحد. لبدء التجربة ، حدد موقع خلية HEK293 صحية تظهر مضان غشائي قوي وموضعي مقارنة بالتألق الداخلي وتجنب ترقيع الخلايا الدائرية لأنها إما تنقسم أو تحتضر. ثم قم بتطبيق نبضة اختبار للتحقق من الاستجابة الحالية.

بعد ذلك، قم بخفض ماصة مشبك التصحيح إلى أعلى سطح الخلية مباشرة. ثم اخفض الماصة ببطء حتى تلامس غشاء الخلية برفق. يجب أن تزيد مقاومة الغشاء إلى واحد إلى اثنين من ميغا أوم.

بعد ذلك ، قم بإنشاء ختم جيجا أوم عن طريق الضغط السلبي برفق عبر الماصة. بمجرد تحقيق مانع تسرب الجيجا أوم، اضبط جهد الماصة عند إمكانية التثبيت المرغوبة. بعد ذلك ، ركز كاميرا CCD عالية السرعة على جسم الخلية.

بالنسبة لتسجيل GEVI المستند إلى FRET، اضبط حجم الصور المنقسمة للحصول على عرض متباعدة بشكل متساو لكل طول موجة للانبعاث باستخدام المقابض الموجودة على مقسم الصورة. ثم قم بتمزيق غشاء الخلية عن طريق الضغط السلبي لتشكيل تكوين الخلية بالكامل. الآن ، افتح برنامج التصوير.

ثم انقر فوق الحصول على قائمة كاميرا SciMeasure لفتح صفحة اكتساب CCD. بعد ذلك ، قم بإنشاء ملف بيانات جديد لحفظ التسجيل. انقر فوق الإخراج التناظري ثم اقرأ ASCII لفتح ملف بروتوكول نبض لإجراء التصوير.

انقر بعد ذلك على متوسط التكرار الداخلي لمتوسط عدد التجارب. ثم أغلق صفحة الإخراج التناظري. قم بتعيين معلمات الاكتساب المحددة في صفحة اكتساب CCD.

بعد ذلك أدخل القيم المحددة لعدد الإطارات للاقتناء وعدد التجارب. ثم انقر فوق أخذ بصريات البيانات بالإضافة إلى BNC زر لبدء التسجيل. أثناء إجراء تصوير الجهد ، راقب راسم الذبذبات لضمان تكوين مستقر للخلية بأكملها طوال التسجيل.

لحساب تغيير التألق الجزئي ، انقر فوق ملف ثم اقرأ ملف البيانات لفتح ملف البيانات الذي تم تسجيله في الخطوة السابقة. يجب رؤية صورة الخلية في شدة الضوء أثناء الراحة على الجانب الأيمن. بعد ذلك ، انقر فوق إظهار BNC لإظهار قيم الجهد النهائي الحالي.

قم بتغيير وضع الصفحة من إطار RLI إلى طرح الإطار من أجل الاستفادة من وظيفة طرح الإطار لتحديد وحدات البكسل ذات الإشارات البصرية سريعة الاستجابة. بعد ذلك ، حدد نقطتين زمنيتين للطرح وحدد منطقة الخلية التي تعرض إشارات استجابة لتغير إمكانات الغشاء. بعد ذلك ، قم بتعيين وحدات البكسل التي تحتاج إلى تحليل عن طريق السحب أو النقر فوق كل بكسل.

يجب أن يظهر التمثيل الرسومي لمتوسط شدة التألق من وحدات البكسل المحددة على الجانب الأيسر من نافذة البرنامج. اقسم وحدات البكسل المطروحة مع شدة الضوء المريحة بالنقر فوق القسمة على زر RLI للحصول على قيم تغيير التألق الجزئي. لتصدير البيانات ، قم بإزالة الرسوم البيانية للجهد النهائي الحالي عن طريق إلغاء النقر فوق إظهار قائمة BNC.

انتقل إلى الإخراج ، واحفظ الآثار كما هو معروض ASCII لتصدير تتبع التألق بتنسيق ملف ASCII لتحليل تركيب المنحنى. في هذا الإجراء ، ارسم الرسم البياني لتغيير التألق مقابل الجهد عن طريق رسم التغيرات الفلورية الجزئية استجابة للجهد في برنامج تحليل البيانات. بعد ذلك ، قم بتركيب المنحنى لوظيفة بولتزمان من أجل تحديد نطاق الجهد للإشارة الضوئية عن طريق النقر فوق التحليل والتركيب والملاءمة السينية ثم فتح مربع الحوار.

أعد رسم التغيرات الفلورية التجزيلية الطبيعية استجابة للجهد باستخدام برنامج تحليل البيانات. لحساب سرعة الاستجابة البصرية ، افتح ملف ASCII وارسم تتبع تغيير التألق الجزئي مقابل الوقت. ثم انقر فوق محدد البيانات في برنامج تحليل البيانات وحدد نقطة زمنية واحدة تتوافق مع بداية نبضة الجهد المتدرجة ونقطة زمنية ثانية حيث وصلت الإشارة الضوئية إلى الحالة المستقرة.

قم بملاءمة هذا النطاق لكل من وظيفة الاضمحلال الأسي الفردية والمزدوجة عن طريق النقر فوق التحليل والتركيب والملاءمة الأسية ثم فتح مربع الحوار والإبلاغ عن الملاءمة الأفضل. يوضح هذا الشكل التغير الفلوري لخلية HEK التي تعبر عن GEVI Bongwoori واحد قائم على FP. هذا تغيير مضان نموذجي استجابة لنبضات الجهد المتدرجة.

هنا تم تصوير خلية HEK293 بكاميرا CCD عالية السرعة. توضح هذه الصورة شدة الضوء المريح لخلية تعبر عن Bongwoori. وهذه صورة طرح إطار تشير إلى وحدات البكسل التي لوحظ فيها تغير الفلورة.

يظهر هنا التسجيل البصري لإمكانات الفعل المستحثة من الخلايا العصبية الأولية للحصين الفأر التي تعبر عن Bongwoori. تم استحضار إمكانات الفعل في ظل وضع مشبك تيارات الخلية بأكملها. تم اختيار أثر تغيير التألق الجزئي من وحدات البكسل المرتبطة بالسوما.

في هذا الشكل ، يظهر التغيير الفلوري لخلية HEK التي تعبر عن GEVI المستند إلى FRET الاستجابات لنبضات الجهد المتدرجة في طولين موجيين. تم تسجيله بسرعة كيلو هرتز واحد بكاميرا CCD عالية السرعة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اختبار مستويات التألق المتغيرة لأن الإفراط في التعبير عن التألق يمكن أن يؤثر على صحة الخلية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل ترميز القطاعة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتضمن نشاط الخلايا العصبية للدوائر المختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير إمكانات الغشاء باستخدام أنواع مختلفة من المسبار.